Л. В. Бибаева д м. н., профессор, зав кафедрой биологии гоу впо согма росздрава
|
Скачать 1.7 Mb.
|
Вывод: При наличии антител в исследуемой сыворотке (положительная реакция) в опытной пробирке гемолиз отсутствует. При отрицательной реакции (нет антител) во всех трех пробирках наблюдается гемолиз. Реакция связывания комплемента проходит в две фазы: 1-ая фаза — взаимодействие исследуемой сыворотки с антигеном и комплементом. 2-ая фаза — индикаторная — определение наличия в смеси свободного комплемента путем добавления гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к эритроцитам барана. Если в первой фазе реакции происходит образование комплекса антиген-антитело, комплемент связывается этим комплексом и во второй фазе гемолиз эритроцитов отсутствует (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу, комплемент в первой фазе реакции остается свободным и во второй фазе реакции присоединяется к комплексу эритроцит-гемолитическая сыворотка, вызывая гемолиз (реакция отрицательная). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — один из современных молекулярно-генетических методов, основанный на принципе многократного копирования (амплификации) определенного участка ДНК или РНК. В результате этого процесса количество определяемой ДНК в пробе возрастает в десятки миллионов раз, что делает возможной последующую детекцию амплифицированной ДНК. Таким образом, ПЦР позволяет выявить ничтожно малые фрагменты ДНК, характерные для определенного вида микробов, и точно идентифицировать этот вид. ПЦР в клетке была открыта более 30 лет назад Нобелевскими лауреатами А.Кронбергом и Д.Ледебергом. Принцип метода ПЦР in vitro был разработан К.Мюлисом в 1983 году, также ставшим Нобелевским лауреатом. Почти немедленно появились сообщения о его практическом применении. Однако в этот период из-за отсутствия необходимого оборудования ПЦР проводили путем ручного переноса пробирок в термостаты с нужной температурой. Необходимый для синтеза ДНК фермент ДНК-полимераза разрушался после каждого этапа денатурации (при 95°С), поэтому требовалось постоянное добавление его новых порций. В 1988 г была получена термостабильная ДНК-полимераза из бактерии Thermophilus aquaticus, живущей в горячих источниках. Были разработаны специальные приборы для амплификации (термоциклеры). Созданы современные лазерные технологии сиквенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Это привело к тому, что ПЦР стал доступным для широкого применения в лабораторной практике. В настоящее время наиболее быстро развиваются пять основных направлений генной диагностики: - инфекционных заболеваний (туберкулез, гонорея, вирусные инфекции — гепатиты В и С, ВИЧ, ЦМВ и др.),
- идентификация личности (трансплантация органов и тканей, судебная медицина, определение отцовства), - диагностика патогенов в пище. Исследуемый материал: кровь, сыворотка, лаважные массы, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы. Постановка ПЦР включает следующие этапы: 1. Выделение ДНК (РНК) из исследуемого материала (пробоподготовка). Клетки лизируют детергентами или высокой температурой. Затем отделяют ДНК от клеточных обломков и разрушают клеточные нуклеазы. Все это обеспечивают приборы: миницентрифуги, развивающие скорость 12000 -14000 оборотов в минуту, вортексы для перемешивания, минитермостаты для пробирок, обеспечивающие быстрое изменение температуры от +30°С до +100°С. 2. Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) нуклеиновых кислот. ПЦР обеспечивает быстрое и многократное умножение, амплификацию (amplification — усиление, увеличение) количества фрагментов генома. Для этого в пробирку с выделенной ДНК добавляют необходимые реактивы и помещают в амплификатор (термоциклер). Этот прибор позволяет циклически изменять и поддерживать перепады температур в пробирке на несколько десятков градусов за несколько секунд. Если в пробирке есть искомая ДНК, то в ней происходит ряд процессов:
Праймер — это последовательность из 15 — 30 нук-леотидов, комплементарная маркерному фрагменту ДНК. При создании оптимальной температуры (45-70°С) происходит связывание (отжиг) праймера с соответствующим участком ДНК: один праймер — на одной нити, другой — на второй нити ДНК. Отжиг протекает в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина — цитозин. - Синтез (элонгация) — достраивание второй цепи ДНК. ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к праймерам, достраивая двухцепочечные фрагменты ДНК (~ при 72°С). Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых цепей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Через 30 — 40 циклов синтезируется такое количество ДНК, которое можно визуально учитывать после электрофореза в агарозном геле или другими способами.  3. Определение (детекция) продуктов ПЦР, полученных на втором этапе.  Выявление наработанного продукта чаще всего проводят при помощи электрофореза в 2-3% агарозном геле, содержащем бромид этидия (специфический флюоресцентный краситель ДНК). Поглощая ультрафиолетовый свет краситель, связанный с ДНК, флюоресцирует. В результате видна оранжевая полоска на уровне контрольной ДНК. Кроме того, используют ферментно-гибридиза-ционный метод или ПЦР в режиме «реального времени» с помощью флюоресцентных красителей. СОДЕРЖАНИЕ: УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №1 Микробиологическая лаборатория, режим работы и назначения. Морфология бактерий. Методы микроскопического изучения бактерий, простой метод окраски бактерий 3 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №2 Структура прокариотической клетки. Сложные способы окраски микроорганизмов 10 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №3 Структура прокариотической клетки 16 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА № 4 Морфология и ультраструктура спирохет, микоплазм, актиномицетов и грибов 20 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №5 Морфология и ультраструктура хламидий и риккетсий. Морфология вирусов 26 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА № 6 Генетика микроорганизмов. Сдача модуля по теме «морфология и генетика микроорганизмов» 31 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №7 Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Питание бактерий. Принципы культивирования микроорганизмов. Питательные среды. Методы стерилизации 37 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №8 Сущность бактериологического метода исследования. Особенности механизмов питания и метаболизма у бактерий 46 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №9 Этапы культивирования аэробных бактерий 51 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №10 Этапы культивирования аэробных (продолжение) и анаэробных бактерий. Дыхательный метаболизм 57 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №11 Антибиотики и химиотерапевтическая терапия 62 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №12 Культивирование вирусов, риккетсий и хламидий 66 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №13 Симбиоз и антагонизм в мире микробов 71 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА № 14 Инфекция (инфекционный процесс) 75 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №15 Неспецифические факторы защиты организма 80 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №16 Физиологические механизмы иммунитета. Иммунная система человека. Антигены и антитела. Гуморальный и клеточный иммунный ответ 85 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №17 Серологический метод лабораторной диагностики. Серологические реакции: реакция агглютинации, реакция непрямой гемагглютинации, реакция преципитации. Диагностикумы и диагностические сыворотки 91 УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №18 Комплементзависимые серологические реакции. Современные серологические и несерологические методы диагностики. Сдача модуля по теме «инфекция и иммунитет» 98 |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка: 