Л. В. Бибаева д м. н., профессор, зав кафедрой биологии гоу впо согма росздрава
|
Скачать 1.7 Mb.
|
| СТЕРИЛИЗАЦИЯ Стерилизация-это обеспложивание, т. е. полное освобождение объектов окружающей среды от микроорганизмов и их спор. Стерилизацию производят различными способами:
В лабораторной практике обычно применяют физические способы стерилизации. Возможность и целесообразность использование того или иного способа стерилизации обусловлена особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими и химическими свойствами. К физическим способам стерилизации можно отнести прокаливание в пламене, стерилизацию сухим жаром в печи Пастера, кипячение, стерилизацию текучим паром в аппарате Коха, паром под давлением в автоклаве, тинда-лизацию, пастеризацию, стерилизацию УФЛ, ультразвуком. Механическая стерилизация осуществляется фильтрованием с помощью бактериальных фильтров, изготовленных из различных мелкопористых материалов, поры фильтров должны быть достаточно мелкими, чтобы обеспечить механическую задержку бактерий. Этим методом стерилизуют питательные среды, содержащие белок, сыворотки, антибиотики; отделяют бактерии от вирусов, фагов, экзотоксинов. В микробиологической практике используют асбестовые фильтры Зейтца, мембранные фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда. а) фильтры Зейтца — диски из смеси асбеста с целлюлозой, толщина их 3-5мм, диаметр 35-140мм; б) мембранные фильтры -из нитроцеллюлозы, толщиной 0,1 мм и диаметром 35мм. В зависимости от размера пор обозначают 1,2,3,4,5; в) свечи Шамберлана и Беркефельда — полые цилиндры, закрытые с одного конца, готовят их из каолина с примесью песка и кварца. Химические способы стерилизации применяют ограниченно, но они служат для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред и иммунобиологических препаратов (вакцин и сывороток). Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков, иногда фагов. Дезинфекция — использование химических веществ (фенол, лизол, хлорамин, перекись водорода, сулема, спирт, и т. д. ) для уничтожения патогенных бактерий в отработанном патологическом материале. Систематизация приборов, процессов обработки и средств для дезинфекции и стерилизации
УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬ СКАЯ РАБОТА №8 Т е м а: Сущность бактериологического метода исследования. Особенности механизмов питания и метаболизма у бактерий Учебная цель: Изучить методику получения чистых культур бактерий из исследуемого материала. Студент должен знать:
Студент должен уметь:
Контрольные вопросы по теме занятия:
Самостоятельная работа студентов
Методические рекомендации
Взять пробирку с исследуемым материалом в левую руку. В правой руке находится стерильная петля, которую следует держать как писчее перо. Правым мизинцем прижать пробку к мякоти ладони, вынуть её из пробирки и держать в руке. Ввести петлю в пробирку, охладить ее о внутреннюю стенку пробирки, взять исследуемый материал петлёй и, не дотрагиваясь до стенок пробирки, вынуть бактериальную петлю. Пробирку и ее край провести через огонь, закрыть пробирку и поставить в штатив. Провести посев материала на питательную среду. При посеве необходимо строго соблюдать определенные правила. Посев производить только вблизи пламени горелки. Чашку с агаром раскрыть только тогда, когда материал находится на петле! Открытую чашку можно держать вертикально или слегка наклонно. Во время посева нельзя разговаривать. Петлю с материалом осторожно приложить к поверхности агара вблизи от края чашки. Затем петлю приложить к другому участку агара и распределить материал петлей параллельными штрихами на расстоянии 0,5 см в двух взаимоперпендикулярных направлениях в виде сетки. Посев петлей проводить осторожно, чтобы не повредить поверхность среды. Для этого петля должна быть всегда параллельна плоскости агара. Это достигается наклоном чашки, находящейся в левой руке. По окончании посева чашку кладут в открытую крышку, петлю прокаливают и ставят в штатив. Надписи делают только на чашке (крышки разных чашек можно случайно перепутать) и посевы помещают в термостат (t°=37°C) на необходимое для роста бактерий время (чаще всего — на 20-24 часа). ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ К ТЕМЕ Общий тип питания у микробов голофитный, т. е. через всю поверхность клетки. Основным барьером, регулирующим поступление питательных веществ в клетку, является ЦМП, т. к. в ней очень мелкие поры, непроницаемые для крупных молекул. Питательные вещества из внешней среды поступают в бактериальную клетку с помощью следующих механизмов: а) пассивная диффузия происходит по градиенту концентрации, без затрат энергии. Таким путем в клетку проникают вода и газы. б) облегченная диффузия (для гидрофильных веществ) — по градиенту концентрации, без затрат энергии, с помощью специальных ферментов — пермеаз. Эти ферменты связываются с субстратом и перемещают его через ЦПМ; в) активный транспорт, который позволяет «накачивать» в клетку молекулы против градиента концентрации. Является основным механизмом поступления питательных веществ в клетку. Энергозависимый процесс, осуществляется с помощью пермеаз; г) перенос радикалов. Этот механизм обеспечивает химические изменения транспортируемых веществ. Так, например, глюкоза вначале фосфорилируется и только в таком виде может пройти через ЦПМ. Это энергозависимый процесс, направленный против градиента концентрации. Классификация микроорганизмов по способу углеродного и азотного питания:
В свою очередь гетеротрофы подразделяются на:
а) облигатные паразиты живут только внутриклеточно и для питания используют органические вещества живых клеток макроорганизма (риккетсии и хламидии); б) факультативные — могут существовать как внутримакроорганизма, так и вне его, утилизируя органические субстраты (шигеллы, сальмонеллы). Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения, называются прототрофами. Но есть и другая группа микроорганизмов, обозначаемая как ауксотрофы. Ауксотрофы — это микроорганизмы, которые вследствие мутаций не способны синтезировать некоторые органические вещества самостоятельно, поэтому должны получать их в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина. Медицинское значение имеет лекарственная ауксотрофность, которая возникает в результате длительной антибиотикотерапии. В частности, современных условиях нередко формируются пенициллинзависимые штаммы, а также стрептомицинзависимые штаммы, которые остаются жизнеспособными только в присутствии соответствующих препаратов. ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕРКИ ЗНАНИЙ Укажите один правильный ответ: 1. Для осуществления активного транспорта веществ в бактериальную клетку необходимо присутствие: а) Транскриптазы; б) Транслоказы; в) Гиалуронидазы; г) Нейраминидазы; д) ДНК-азы. 2. Процесс биологического окисления субстрата осуществляется микробной клеткой в: а) Рибосомах; б) Мезосомах; в) Митохондриях; г) Внутриклеточных включениях; д) Лизосомах. 3. По типу питания бактерии, вызывающие болезни у людей, относятся к: а) Гетеротрофам; б) Автотрофам; в) Прототрофам; г. Ауксотрофам; д) Гемотрофам. 4. По способу получения энергии бактерии, вызывающие болезни у людей, относятся к: а) Хемоорганотрофам; б) Фотоорганотрофам; в) Хемолитотрофам; г) Фотолитотрофам; д) Гемотрофам. 5. Плотность питательных сред зависит от содержания: а) Сыворотки крови; б) Сахарозы; в) Агар-агара; г) Пептона. 6. Микробы, использующие неорганические источники углерода хемосинтетические реакции для получения энергии называются: а) Фотолитотрофами; б) Фотоорганотрофами; в) Хемолитотрофами; г) Хемоорганотрофами; д) Истинными хемоорганотрофами. Укажите все правильные ответы: 7. К простым средам относятся: а) МПА; б) Пептонная вода; в) Кровяной агар; г) Среда Гисса; д) МПБ; е) Сывороточные среды; 8. К сложным средам относятся: а) МПА; б) Пептонная вода; в) Кровяной агар; г) Среда Гисса; д) ЖСА; е) Асцит-агар. 9. Селективные (элективные) питательные среды можно использовать для: а) Выделения определённого вида микробов; б) Изучения протеолитических свойств микробов; в) Изучения культуральных свойств микробов; г) Изучения сахаролитических ферментов микробов; д) Первичного посева материала; е) Консервации и транспортировки материала. 10. В жидкой питательной среде рост микробов может наблюдаться в виде: а) Колоний; б) Диффузного помутнения; в) Придонного помутнения; г) Пристеночного налёта. 11. Сложные среды, содержащие белковые и углеводные компоненты, стерилизуют: а) Дробно — текучим паром; б) Кипячением; в) Сухим жаром в печи Пастера; г) Тиндализацией; д) Фильтрованием, е) Химической дезинфекцией. 12. Среды, содержащие сахара и другие углеводы, стерилизуют: а) Автоклавированием; б) Кипячением; в) Сухим жаром в печи Пастера; г) Тиндализацией; д) Фильтрованием; е) Дробно — текучим паром. УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №9 Т е м а: Этапы культивирования аэробных бактерий Учебная цель: Изучить методику выделения чистых культур бактерий из исследуемого материала. Контрольные вопросы по теме занятия:
Студент должен знать: 1. Овладеть методами выделения чистых культур бактерий. 2. Освоить методы культивирования аэробов. Студент должен уметь: 1. Выполнение второго этапа выделения чистой культуры аэробов. 2. Приготовление мазка, окраска по Граму. 3. Охарактеризовать макроскопические выросшие колонии. 4. Пересеять намеченную колонию на скошенный агар. Самостоятельная работа студентов Результаты 1-го этапа бактериологического метода: 1. Макроскопическая характеристика колоний, выросших на чашке с МПА (цвет, форма, размер, характер краев, характер поверхности, консистенция).
Методические рекомендации 1. Второй день работы включает изучение колоний, выросших на чашке с МПА, и пересев намеченных колоний на скошенный агар для получения чистых аэробных культур. На столе у студента имеется чашка с МПА с выросшими на поверхности агара колониями. Изолированные колонии, отличающиеся по внешнему виду, отмечают стеклографом на наружной поверхности стекла чашки, нумеруют: 1, 2, 3 и т. д. Каждую отмеченную колонию охарактеризовывают макроскопически: форма, цвет, характер краев, поверхности, прозрачность, размер. Заносят характеристики разных колоний в протокол. 2. Из колоний Гр. - отрицательных палочек сделать отсев на скошенный агар для получения чистой культуры. Для этого надо прокалить бактериальную петлю и подождать, пока она остынет (10-15 сек). Кончиком петли едва коснуться отмеченной колонии, не захватывая агар. После этого взять в левую руку пробирку со скошенным агаром так, чтобы поверхность скошенного агара была перед глазами. Открывать пробирку нужно так, чтобы пробка осталась в правой руке, прижатой мизинцем к ладони. Нельзя класть пробку на стол! Петлю с материалом внести в пробирку, не касаясь внутренних стенок, до дна пробирки, где находится большее количество конденсационной жидкости. Поверхностью петли прикоснуться к поверхности агара и сделать посев змеевидным штрихом, продвигаясь снизу вверх. Обжечь на пламени края пробирки и пробку, закрыть пробирку, поставить её в штатив. Бактериальную петлю прокалить и также поставить в штатив. Пробирку поместить в термостат при t 37°C. ИНФОРМЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ ПО ТЕМЕ Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Методы культивирования и получения чистой культуры аэробов. Основным методом диагностики инфекционных заболеваний является бактериологический. Сущность этого метода — посев исследуемого материала (кровь, моча, фекалии, мокрота, мазок из зева и носа и др. ) на искусственные питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя с последующей его идентификацией по морфологическим, тинкториальным, куль-туральным, биохимическим, антигенным. Выделение чистой культуры возбудителя лучше достигается путем посева на плотные питательные среды, что приводит к механическому разобщению отдельных микробных клеток друг от друга. При оптимальной температуре (обычно 37 С) размножение изолированных клеток дает потомство (колонию) одного вида, т. е. чистую культуру данного вида микробов. Получение чистой культуры аэробов Для получения изолированных колоний аэробов производят посев на пластичатые среды (в чашки Петри) следующими способами: а) стеклянным шпателем последовательно на три чашки — по Дригальскому; б) на одной чашке шпателем — площадками; в) бактериологической петлей секторами. Методические рекомендации Ко второму этапу бактериологического метода исследования.
Установление вида микроба может складываться из различного рода признаков: микроскопических — особенности формы, окраски и расположения клеток в мазке; макроскопических — форма, цвет и другие черты колоний на плотной среде. Наиболее основательными являются биохимические признаки идентификации, характеризующие набор ферментов у данной культуры. Этот признак является наиболее стабильной и индивидуальной характеристикой микроба. Наличие ферментов у микроба чаще всего определяют путем посева «чистой культуры» в среды «пестрого ряда», в каждой пробирке которого содержится только один углевод. Протеолитические ферменты определяют путем посева культуры в МПБ, где с помощью индикаторных бумажек определяют образование индола и сероводорода. Комплекс выявленных свойств микроба позволяет, чаще всего, установить его вид. Выделение чистой культуры аэробов (продолжение). II этап исследования. Учет характера роста на пластинчатом МПА. Обратить внимание на два вида выросших колоний: 1) средних размеров, полупрозрачные, 2)мелкие, непрозрачные. В дальнейшем необходимо провести более полное макроскопическое, а также микроскопическое исследование этих колоний с подробным описанием в протоколе исследования. Макро- микроскопическое изучение выросших колоний
В целях изучения морфотинкториальных свойств часть колоний используют для приготовления мазка и окрашивают его по Граму. Затем мазки микроскопируют. После микроскопии другую часть пересевают для выделения чистой культуры и накопления биомассы на следующие питательные среды: колонию № 1 — МПБ, колонию № 2 — скошенный МПА. Этапы посева в МПБ: а) прокалить петлю, приоткрыть чашку Петри с культурами, остуженной петлей набрать культуру из колонии № 1, закрыть чашку; б)над пламенем спиртовки открыть пробирку с МПБ, внести петлю с культурой в глубину МПБ, закрыть над пламенем пробирку, прокалить петлю. Этапы посева на скошенный МПА: а)забрать культуру из колонии №2 также, как из колонии №1; б)над пламенем спиртовки открыть пробирку со скошенным МПА, внести петлю с культурой до дна пробирки и, скользя петлей делаем посев по поверхности агара зигзагообразно снизу вверх. Закрыть пробирку, прожечь петлю. Посев помещают в термостат при 37° С на 24 часа. ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕРКИ ЗНАНИЙ Укажите все правильные ответы: 1. На 1 этапе бактериологического метода исследования решаются следующие задачи: а) идентификация чистой культуры микробов; б) определение чувствительности к антибиотикам; в) получение изолированных колоний; г) определение вида микроба; д) получение чистой культуры. 2. Преимущественный рост одних видов микробов при одновременном подавлении других можно получить на следующих видах питательных сред: а) селективных (элективных); б) простых; в) сложных; г) консервирующих; д) дифференциально-диагностических; е. универсальных; ж. оптимальных. 3. Ферменты в химическом отношении содержат: а) субстрат; б) апофермент; г) кофермент; д) метаболит 4. Основные особенности метаболизма у прокариот: а) отсутствие типичных ферментов; б) высокая интенсивность; в) выделения экзоферментов; г) высокая проницаемость клеточной стенки и ЦПМ для относительно крупных молекул; д) отсутствие активного транспорта; е) транспорт с участием поринов. 5. В понятие «культуральные свойства» микроба входит: а) характер роста на питательных средах; б) макроскопическая характеристика колоний; в) морфология микробных клеток при микроскопии; г) ферментация углеводов на средах Гисса; д) цвет пигмента колоний или культуры; е) отношение возбудителя к окраске по Граму. 6. На рост бактерий влияют следующие условия культивирования: а) газовый состав; б) содержание в питательной среде органических соединений; в) факторы роста; г) рН среды; д) влажность среды; е) все ответы неправильные. 7. Высокая интенсивность метаболизма у прокариот обусловлена а) отсутствие типичных ферментов; б) ферментативной насыщенностью; в) выделение экзоферментов; г) высокая проницаемость клеточной стенки и ЦПМ для относительно крупных молекул; д) оптимальным соотношением площади ЦПМ к объёму клетки; е) отсутствием адаптивной способности. 8. Амфиболизм характеризуется: а) расщеплением субстратов; б) превращением промежуточных метаболитов; в) превращением энергии; г) биосинтетическими процессами. 9. На I этапе бактериологического метода готовят мазок из изолированной колонии и микроскопируют его для: а) определения тинкториальных свойств микроба; б) получения чистой культуры; в) изучения биохимических свойств микроба; г) изучения макроскопической характеристики колоний; д) изучения микроскопической характеристики колоний. 10. Энергия в микробной клетке запасается в виде: а) УДФ; б) волютина; в) АДФ; г) НАДФ; д) ФАД; е) СО2. 11. Основные цели применения дифференциально-диагностических сред: а) изучение биохимической активности микробов; б) изучения культуральных свойств микробов; в) определения чувствительности к антибиотикам; г) дифференциация различных видов микробов; д) транспортировка материала в лабораторию. 12. Установите соответствие основных фаз кривой роста бактериальной популяции и характеристики состояния популяции:
а) гибель клеток превышает частоту деления; б) адаптация к питательной среде и условиям; в) быстрое увеличение численности популяции; г) процессы деления и гибели клеток сбалансированы; е) быстрое сокращение численности популяции. УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №10 Т е м а: Этапы культивирования аэробных (продолжение) и анаэробных бактерий. Дыхательный метаболизм Учебная цель:
Студент должен знать: 1. Проведение бактериологического исследования по выделению чистой культуры аэробов (результаты второго этапа исследования). 2. Методы культивирования анаэробов. 3. Среды для культивирования, аппаратура для культивирования анаэробов. Студент должен уметь:
Контрольные вопросы по теме занятия: 1. Характеристика второго этапа бактериологического метода исследования. 2. Способы идентификации бактерий.
5. Типы дыхания бактерий. Брожение. Микроаэрофилы. 6. Методы культивирования анаэробных бактерий. 7. Достоинства и недостатки бактериологического метода исследования. Самостоятельная работа студентов
3. Демонстрация дифференциально-диагностических сред (среда Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса, систем Api). 4. Демонстрация техники анаэробного культивирования и сред для анаэробов: высокий столбик агара, среда Китта-Тароцци, тиогликолевая, Стюарта. Демонстрация микроанаэростата. Способы: Фортнера, Вейнберга. III этап исследования. Через 24 часа на скошенном МПА обнаружен однородный рост в виде сплошного налета желтоватого цвета, а в МПБ — диффузно-мутящий рост. С целью проверки чистоты выделения культуры из каждой пробирки приготавливают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для оценки чистоты культуры необходимо просматривать не менее 10 полей зрения. Нахождение в мазках со скошенного МПА только гроздьевидно-расположенных грамположительных кокков, а в мазках их МПБ — грамотрицательных палочек свидетельствует о чистоте выделенных культур. Для определения биохимических бактерий производят посев выделенной культуры в среды цветного ряда (глюкоза, лактоза, маннит, сахароза, мальтоза и в МПБ для определения индола и сероводорода), или определяют эти свойства с помощью Системы Индикаторных Бумажных дисков (СИБ). Посевы помещают в термостат при температуре 37°С на 24 часа. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка: 