Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология





Скачать 250.98 Kb.
НазваниеЁ махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
САЙДАРОВА МУХАЙ
Дата конвертации31.05.2013
Размер250.98 Kb.
ТипАвтореферат диссертации
На правах рукописи


САЙДАРОВА МУХАЙЁ МАХМАДРАХИМОВНА


РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА ПТИЦ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН: ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ


06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология


Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата ветеринарных наук


МОСКВА – 2011


Работа выполнена на Научно – производственном предприятии «Биологические препараты» Таджикской академии сельскохозяйственных наук (НПП БП ТАСХН)


Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

Амирбеков Муллоджон


Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Соловьёв Борис Васильевич


доктор ветеринарных наук, профессор

Масимов Нусрат Абулфатович


Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности.


Защита диссертации состоится «17» мая 2011года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно – исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко Российской Академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии) по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, д.24 корп. 1, ВИЭВ.


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии.


Автореферат разослан «______ » апреля 2011 года.


Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Ездакова И.Ю.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грипп птиц (кур) – острая высококонтагиозная вирусная болезнь птиц, характеризующаяся общим угнетением, отёками, поражением органов дыхания, пищеварения и ЦНС. Болезнь впервые описал Перрончито (1880) в Италии под названием «экссудативный тиф кур». Впоследствии она неоднократно возникала во многих странах мира, где её диагностировали под разными названиями, в том числе как европейскую или классическую чуму птиц. Вирусную природу возбудителя (классической, европейской) чумы птиц установил Чентани в 1901 г., а в 1955 г. возбудитель был идентифицирован как influenza virus A, и после этого с 1971 г. болезнь стали называть гриппом птиц (Конопаткин А.А., Бакулов И.А. и др., 1983, Кельмик Д.У., 2003).

В течение XX века вспышки болезни, вызванные разными штаммами, происходили во многих регионах мира, в том числе в Северной и Южной Америке, на севере Африки, в странах Среднего и Дальнего Востока, Европе и бывшем Советском Союзе. Из числа выделенных возбудителей высокой вирулентностью для птиц обладают вирусы подтипов Н5N1 и Н7N7.

В природе у диких птиц встречаются практически все известные подтипы вирусов гриппа типа А. При этом существует механизм рекомбинации поверхностных антигенов гемагглютинина и нейраминидазы. Вирусы, которые авирулентны для своих носителей, имеют широкий круг хозяев, включая другие виды птиц и млекопитающих. Важным фактором эффективной передачи таких вирусов другим видам, в частности водоплавающим птицам, может быть репликация вирусов в кишечном тракте птиц; этот резервуар в живой природе играет важную роль в экологии вирусов гриппа (Джавадов Э.Д., Придыбайло Н.Д., Амдий Э.М., Мирзоев Д.М., Салимов, Т.М., 2008). Весьма важным фактом, определяющим актуальность наших исследований, является определенная связь между заболеванием людей и вспышками гриппа птиц. В последние годы некоторые подтипы вирусов птичьего гриппа зачислены в число опасных для человека. В Соединенных Штатах Америки каждый год более 200 000 пациентов обращаются в больницы из - за гриппа и регистрируется приблизительно 36 000 смертельных случаев. В 328 случаях вирус подтипа H5N1 вызвал заболевание и в 200 случаях со смертельным исходом (Lipman D. Journal of Virology, January 2008).

В Таджикистане проблема гриппа птиц изучена не достаточно. В республике до настоящего времени не зарегистрирован высокопатогенный подтип вируса H5N1, но в различные годы были обнаружены штаммы других подтипов ВГП: 6-й (1972 г.), 7-й (1976-1978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг.) (Салимов Т.М., Фатхудинова М.Ф., 2008). Вопрос нельзя считать закрытым, принимая во внимание постоянную циркуляцию вируса H5N1 в соседних странах, возможность переноса возбудителей с дикими птицами, маршруты перелёта которых пролегают через территорию Таджикистана.

В Таджикистане наряду с птицеводческими хозяйствами промышленного типа значительное поголовье кур содержится в мелких фермерских и частных подворных хозяйствах. Эта птица обычно имеет свободный выгул, и по этой причине возможны множественные контакты с дикими и синантропными птицами - потенциальными носителями штаммов вируса гриппа. Следовательно, наблюдение за распространением гриппа птиц весьма важно для прогнозирования возможных эпизоотических вспышек болезни и организации противоэпизоотических мероприятий.

Кроме того, согласно «Санитарного кодекса наземных животных» -официального издания Международного эпизоотического бюро, членом которого является Республика Таджикистан, все страны обязаны предоставлять другим странам - членам МЭБ любую информацию по предупреждению распространения опасных болезней животных (ст. кодекса 1.1.2.).

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным была поставлена цель - провести мониторинг гриппа птиц с использованием иммунологических (серологических) тестов для определения возможной циркуляции вирусов в популяции домашней птицы в различных регионах Республики Таджикистан и разработать рекомендации по предупреждению эпизоотических вспышек болезни.

Для достижения указанной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Отработать методики иммунологического (серологического) мониторинга вируса гриппа птиц различных подтипов.

2. Разработать тест - систему для выявления антител к высокопатогенному вирусу гриппа птиц H5N1 в ИФА.

3. Изучить возможность выявления потенциальных очагов возбудителя гриппа с гемагглютинином Н7 и Н3 с использованием вирусов гриппа лошадей «А/лошадь1/Прага56» (H7N7) и «А/лошадь2/Майами 63» (H3N8).

4. Провести серологическое обследование домашних птиц (в РТГА) для выявления специфических антител к различным подтипам вируса гриппа птиц.

5. На основании полученных данных разработать практические предложения по профилактике инфекции.

Научная новизна исследования. Впервые в Республике Таджикистан установлена циркуляция ранее не регистрировавшихся вирусов гриппа птиц, нескольких подтипов. Проведенным исследованием на 12 подтипов вируса гриппа, положительные результаты в РТГА получены с вирусами: H3, H6, H8, H11, H12, H13.


Установлено, что непрямой вариант твердофазного ИФА (иммуноферментный анализ) вследствие высокой чувствительности позволяет выявлять скрытые очаги инфекции, в которых не наблюдают манифестные формы гриппа птиц H5N1.

При отрицательных результатах на вирус H5N1 в РТГА, получены совпадающие положительные результаты в ИФА и иммуноблотинге с использованием моноклональных антител.

Установлено, что гетерологичные вирусы «А/лошадь1/Прага 56» (H7N7) и «А/лошадь 2/Майами 63» (H3N8), использованные в тест-системе ИФА выявляют антитела к общим поверхностным антигенам возбудителей гриппа птиц.


Указанное позволяет использовать гетеротипичные вирусы «А/лошадь1/Прага 56» (H7N7) и «А/лошадь 2/Маями 63» (H3N8) для иммунологического мониторинга и выявления скрытых очагов вирусов гриппа птиц содержащих геммаглютинины Н7 и Н3.

Практическое значение работы. Установлено, что в птицеводческих хозяйствах разного типа ряда районов Республики Таджикистан, несмотря на отсутствие в последние годы зарегистрированных вспышек гриппа птиц, циркулируют штаммы возбудителя, отнесенные к низкопатогенным подтипам вируса гриппа птиц. Выявлены очаги на территории, которых у домашней птицы обнаруживаются антитела к высокопатогенным подтипам вируса H5N1 и H7N7, что очевидно связано с циркуляцией низковирулентных штаммов, представляющих потенциальную опасность для домашней птицы.

Проведена апробация нескольких тестов, для целей лабораторной диагностики и мониторинговых исследований, а именно: ИФА-выявление антител к группоспецифическому белку вируса гриппа А; ИФА и иммуноблотинга- определение антител к поверхностным гликопротеинам вируса. Разработаны наборы ИФА для ретроспективной диагностики высокопатогенных вирусов гриппа птиц (H5N1 и H7N7). В качестве компонентов тест - систем методом ИФА, предназначенных для ретроспективной диагностики гриппа птиц H7 и H3, могут использоваться гетеротипичные вирусы «А/лошадь1/Прага56» (H7N7) и А/лошадь2/Майами63 (H3N8).

Применение апатогенного для птиц штамма А/лошадь1/Прага56» в диагностическом наборе взамен высоковирулентного вируса H7N7 гриппа птиц, обеспечивает биологическую безвредность диагносткума и снижает опасность для окружающей среды.

Полученные данные использованы при разработке системы профилактических мероприятий против гриппа птиц в Республике Таджикистан.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 10-м Международном конгрессе Всемирной Конской Ветеринарной Ассоциации (г. Москва, 2008), Ученом Совете Научно – производственного предприятие «Биологические препараты» Республики Таджикистан (Душанбе, 2010), Ученом Совете ГНУ «Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Ковалено» (Москва, 2011). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно - производственном совещании научных сотрудников Научно – производственного предприятия «Биологические препараты» Республики Таджикистан (Душанбе, 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:


- данные исследований, характеризующие циркуляцию вирусов сптиц различных подтипов, которые ранее не регистрировались в Республике Таджикистан.

- результаты экспериментальных исследований, обосновывающие использование метода непрямого твердофазного ИФА для мониторинговых исследований на грипп птиц H5N1, позволяющие вследствие высокой чувствительности метода, выявлять скрытие очаги инфекции при отсутствии манифестных форм гриппа.

- результаты разработки твердофазного ИФА для выявления антител к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа птиц H5N1.

- материалы исследований, обосновывающих перспективность использования гетеротипичных вирусов «А/лошадь1/Прага56» (H7N7) и «А/лошадь 2/Маями 63» (H3N8), в составе тест-систем ИФА для выявления антител к вирусам гриппа птиц H7 и H3.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования, анализ и обобщение результатов выполнены автором самостоятельно при участии научного руководителеля д.в.н., М. Амирбекова. Исследования по разработке ИФА с гомологичными и гетерологичными антигенами вируса гриппа птиц выполнены совместно с к.б.н. Г.К. Юровым, к.б.н. С.В. Алексеенковой, В.В. Ивановым в период прохождения стажировки в отделе вирусологии ВИЭВ. Часть исследований по серодиагностике гриппа птиц выполнены совместно с сотрудниками Национального центра ветеринарной диагностики и Службы государственного ветеринарного надзора МСХ РТ - Тиллоевым Т., Зухурбековой О. «Пособие для ветеринарных специалистов по борьбе с птичьим гриппом» разработано совместно с Мамадшоевым М.М. и Тошматовым Н. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи сотрудникам ГНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко д.в.н., профессору К.П. Юрову, к.б.н., Г.К. Юрову и к.б.н., С.В. Алексеенковой.


Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 3 в изданиях рекомендованных ВАК РФ (Журналы «Иммунология», «Ветеринарная патология» и «Кишоварз (Земледелие)»).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, результаты исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы содержит 159 источника, из них – 140 иностранные. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 12 рисунками.



СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в лаборатории вирусных болезней животных Научно – производственного предприятия «Биологические препараты» Таджикской академии сельскохозяйственных наук (НПП БП ТАСХН) в период 2007 - 2011 гг.

Материалы.

Сыворотки кур. Сыворотки были получены от кур из птицефабрик и мелких подворных хозяйств различных регионов республики Таджикистан: ГБАО – Рушон, Чилликул, Кабодиян, Файзабад, Варзоб, Вахдат, Рашт, Шахринав.

Вирусы. В работе использовали штамм «А/сk/Skot/59» (H5N1) вируса гриппа птиц из музея вирусных штаммов Научно – производственного предприятия «Биологические препараты», предоставленный Центром ВОЗ в порядке научно-технической помощи Республике Таджикистан по программе «Проект по контролю за птичьим гриппом», штаммы «А/лошадь1/Прага/56» (H7N7), «А/лошадь2/Маями63» (H3N8) вируса гриппа лошадей получены из музея отдела вирусологии ВИЭВ.

Куриные эмбрионы. Для размножения вируса гриппа птиц и гриппа лошадей использовали SPF куриные эмбрионы в возрасте 9 – 10 суток.

Лабораторные животные. Гипериммунные сыворотки получали на кроликах на экспериментальной базе Научно – производственного предприятия «Биологические препараты» Республики Таджикистан.

Коммерческие диагностические наборы:

- «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)», произ. «х-OvO», Великобритания;

- «Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)», произ. ОАО «Покровский завод биопрепаратов», Россия.

- «Диагностические антигены и сыворотки для РТГА»; «Инактивированный антиген вируса гриппа птиц подтипа H5N1», произ. ФГУ «ВНИИЗЖ», Россия.

- «AniGen H5 AIV Ag ELISA», произ. «Animal Genetics, Inc», Южная Корея.

Реактивы. Необходимые для проведения работы растворы готовили из реактивов фирм «Химмед», «Биолаб», «Литех», «Хеликон» (Россия); «Anigen Animal Gеnetics, Inc» (Южная Корея); «Биорад» (США) и др.

Методы.

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Для заражения вирусом гриппа птиц «А/сk/Skot/59» (H5N1) использовали 9 -10 дневные СПФ куриные эмбрионы. Для предотвращения бактериального заражения использовали антибиотики широкого спектра действия (стрептомицин и пенициллин 1000 ед/мл). Эмбрионы заражали в аллантоисную полость по 0,2 мл вируссодержащей эмбриональной жидкостью в разведении 1:100 - 1:1000 и инкубировали при температуре 370С в течение 48 часов. Зараженные эмбрионы просматривали через 6, 8, 12, 24, 48 часов после заражения под овоскопом. Погибшие эмбрионы охлаждали, помещая в холодильник при 4 - 6оС, вскрывали в асептических условиях и собирали эмбриональную жидкость для последующей работы. Пробы крови у кур получали из подкрыльцовой вены.

РТГА проводили на иммунологических планшетах с V- образными лунками с 1% суспензией куриных эритроцитов согласно рекомендациям изложенным в издании МЭБ «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals», Издание 6, 2008.

Иммуноферментный анализ. Для проведения экспериментальных исследований был использован непрямой вариант твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу гриппа птиц. При постановке ИФА антиген (вирионы, очищенные ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы) адсорбировали на иммунологические планшеты (производства фирмы «Greiner – bio», Германия) по 100 мкл в лунку в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4. После адсорбции лунки планшет промывали 4 – 5 раз промывочным раствором. Для промывочного раствора использовали ФСБ с добавлением Твина -20 (0,02М фосфатного буфера рН 7,4; 0,05% Твина – 20). Готовили ряд последовательных двукратных разведений сывороток в ФСБ с добавлением Твина - 20 (0,02 М фосфатном буфере рН 7,4, 170 мМ NaCl; 0,05% Твина – 20). Реакцию проводили в объёме 100 мкл. Инкубировали с исследуемыми сыворотками 1,5 часа при t +37◦C. Лунки планшет 3 – 4 раза промывали промывочным раствором и добавляли иммунопероксидазный конъюгат. В качестве конъюгата использовали антитела против иммуноглобулинов кур, полученные на кролике, конъюгированные с пероксидазой хрена. Инкубацию с конъюгатом проводили в условиях аналогичных инкубации с сыворотками. По окончании инкубации лунки планшет промывали 4 – 5 раз промывочном раствором и проявляли реакцию внесением в каждую лунку субстратной смеси. В качестве субстратной смеси использовали коммерческий препарат «ТМБ» на основе хромогена 3, 3’,5,5’– тетраметилбензидина (производства фирмы «Биолаб», Россия). Окраску субстратной смесью проводили по протоколу фирмы - изготовителя. Результаты ИФА оценивали на фотометре «Multiscan®МСС/340» с вертикальным лучом при длине волны 450 нм по коэффициенту оптического поглощения (ОП, 450). Положительными считали пробы, коэффициент оптического поглощения которых, начиная с разведения 1: 200 в 2 и более, раз превосходил коэффициент оптического поглощения отрицательного контроля, но при этом был не ниже 0,200 оптических единиц (о.е.). Уровень оптической плотности ниже 0,150 о.е. принимали за отрицательный результат.

Иммуноблоттинг. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили в буферной системе Лемли в 12% ПААГ толщиной 0,75 мм. Электроперенос белков после их разделения в ПААГ – ДСН проводили по методу Бюрнет с небольшими модификациями на нитроцеллюлозу. Иммуноблотинг проводили с сыворотками кур по общепринятой методике. Для проявления реакции использовали субстратную смесь на основе хромогена – ортодианизина.

Статистическая обработка. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel 2003, используя рекомендации Д.А. Новикова, В.В. Новочадова. Для результатов измерения в шкале отношений применяли показатель описательной статистики – «гистограмму», т.е. графическое изображение зависимости частоты попадания элементов выборки от соответствующего интервала группировки (Новикова Д.А., Новочадова В.В. «Статистические методы в медико - биологическом эксперименте (типовые случаи)» 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В Таджикистане проблема гриппа птиц изучена не достаточно. В различные годы были обнаружены штаммы нескольких подтипов ВГП: 6-й (1972 г.), 7-й (1976-1978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг.) (Салимов Т.М., Фатхудинова М. Ф. 2008г.).

Исследования, проведенные совместно с сотрудниками Национального центра ветеринарной диагностики и Таджикского научно-исследовательского института профилактической медицины (3945 проб сыворотки крови, 51 трупа птиц - оседлых и перелётно-гнездящиеся видов; 226 трахеальных и клоачных мазков от домашних, диких и синантропных птиц), свидетельствовали об отсутствии в Таджикистане вируса с антигенной формулой H5N1. Однако, полученные результаты нельзя считать окончательными, учитывая неблагополучие по гриппу птиц сопредельных государств, и маршруты перелетных птиц, пролегающих через территорию Республики. Указанное послужило основанием для продолжения наших исследований.

Обнаружение типоспецифических антител к вирусу гриппа А птиц.

Использовали коммерческий набор для ИФА на основе «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)», производитель «x-OvO» Великобритания. Сыворотки для исследования были получены из районов Вахдат, Рашт, Файзобад, Шахринав. Результаты представлены на рис.1.

Как видно из данных на рис. 1, антитела к типоспецифическому белку гриппа А в достоверно- диагностических титрах выявляли в пробах, полученных в 4-х административных районах (Вахдат, Рашт, Файзабад, Шахринав). Наиболее высокие титры антител обнаруживали в сыворотках, полученных из района: Шахринав и в более низких титрах - в пробах из других 3-х районов.





Наличие иммунного ответа у кур на типоспецифический белок вируса гриппа А свидетельствует о циркуляции возбудителя гриппа в популяции птиц на территории Республики Таджикистан. Полученные результаты послужили основанием для продолжения исследований с целью выяснения в плане ретроспективной диагностики подтиповой принадлежности вирусов гриппа птиц.

Первостепенное значение придавали изучению возможной циркуляции высокопатогенного вируса гриппа птиц H5N1. В связи с этим нами была разработана тест система ИФА для выявления антител к поверхностным антигенам этого вируса.

Разработка тест–системы для определения антител к поверхностным антигенам H5 вируса гриппа птиц методом ИФА.

Получение антигена. В качестве исходного вируссодержащего материала использовали штамм вируса гриппа птиц «А/сk/Skot/59» (H5N1), предоставленный Центром ВОЗ в порядке научно-технической помощи Республике Таджикистан по программе «Проект по контролю за птичьим гриппом» из музея вирусных штаммов Научно – производственного предприятия «Биологические препараты» Республики Таджикистан.

Для заражения вирусом гриппа птиц использовали 9-10 дневные СПФ куриные эмбрионы. Собранную вируссодержащую жидкость использовали для приготовления антисыворотки (антител) для иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого вирус очищали следующим методом: для избавления от дебриса вируссодержащ уюэмбриональную жидкость осветляли низкоскоростным центрифугированием в роторе J2-21N/E (центрифуга BECKMAN) в течение 20 минут при 6 000 об/мин. Из декантированного супернатанта готовили концентрированный вируссодержащий осадок, который был получен после центрифугирования в роторе J2-21N/E (центрифуга BECKMAN) в течение 2-х часов при 20 000 об/мин. Частично очищенную находящуюся в осадке вирусную массу ресуспендировали в физиологическом растворе и наслаивали на градиент 30% - 65% сахарозы. Ультрацентрифугирование проводили в роторе 41 (центрифуга BECKMAN) при 35 000 об/мин, в течение 2-х часов. Опалесцирующую зону отбирали и анализировали в иммуноферментном анализе методом шахматного титрования. По результатом шахматного титрования были определены оптимальные разведения антигена для его дальнейшего использования в иммуноферментном диагностикуме.

Получение моноспецифических гипериммунных антисывороток против иммуноглобулинов кур класса G и приготовление иммуноспецифического конъюгата.

Моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам кур класса G для постановки ИФА получали иммунизацией кроликов. Иммунизацию проводили путем подкожной инъекции суспензии иммуноглобулина и адъюванта Фрейнда. Очищенные иммуноглобулины кур класса G, были получены методом анионообменной хроматографии. В качестве сорбента использовали DEAE-TP. После завершения иммунизации отбирали кровь иммунизированных кроликов путем тотального обескровливания. Отделяли сыворотку и определяли концентрацию иммуноглобулинов спетрофотометрически при длине 280 Нм. Гипериммунные сыворотки, использовали для получения моноспецифических антител конъюгированных с ферментом (пероксидаза хрена).

В результате был получен иммунопераксидазный коньюгат, который использовали в экспериментах для обнаружения специфических антител к вирусу гриппа кур. Активность коньюгата была определена в разведение 1:1000. Указанная тест-система использована нами для мониторинга вирусов гриппа птиц, включающих гемааглютининпятого типа. Сыворотки для исследования получены от кур птицефабрик и мелких подворных хозяйств 8 районов Республики Таджикистан: Рушон - ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб, Вахдат, Рашт, Шахринав (рис.2).



Описание к рис. 2 - районы Республики Таджикистан: 1) Рушон - ГБАО; 2) Джилликул; 3) Кабадиян; 4) Файзабад; 5) Варзоб; 6) Вахдат; 7) Рашт; 8) Шахринав. К- - отрицательный контроль; К+ - положительный контроль.

В районах 1-5 проводилась вакцинация кур инактивированной вакциной из шт.H5N1.

Наиболее высокие титры антител выявлены в пробах из района Шахринав, что коррелирует с результатами, представленными на рис. 1, которые демонстрируют циркуляцию антител у домашней птицы к типоспецифическому белку гриппа А. Данные, полученные по районам 1-5 (Рушон - ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб) по-видимому, объясняются проведённой вакцинацией кур против гриппа и возможно не отражают истинную картину распространения эпизоотического вируса. Поскольку в этих районах применялось «Инактивированная эмульгированная вакцина против птичьего гриппа из шт. H5N1», ОАО «Покровский завод биопрепаратов». Однако, в связи стем, что отсутствуют сведения об иммуногенный активности вакцины к внутреннему типоспецифическому белку вируса, мы можем с некоторой долей осторожности допустить, что выявленные антитела к РНП гриппа А, на самом деле индуцированы эпизоотическим штаммом вируса гриппа H5N1.


Подтверждение специфичности результатов

иммуноферментного анализа методом иммуноблотинга

Для подтверждения специфичности иммуноферментного анализа с полученными очищенными вирионами нами был проведён иммуноблотинг, после проведение вертикального электрофореза в денатурирующих условиях с прогреванием в присутствии восстанавливающего дисульфидные связи реагента DTT (дитиотреитол), с пробами, давшими положительную реакцию на антитела к типоспецифическому белку гриппа птиц А. Для определения молекулярной массы был поставлен контроль с использованием моноклинальных антител против гемагглютинина Н5 из коммерческого набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA» фирмы «Animal Gеnetics, Inc»; производитель Корея,

Установлено, что сыворотки положительно реагировавшие с типоспецифическим антигеном гриппа А взаимодействуют с вирусным гликопротеином с молекулярной массой 35 кД, что соответствует молекулярной массе субъединицы гемагглютинина вируса гриппа. Следовательно, результаты иммуноблотинга подтверждают специфичность выше приведенных данных.


РТГА для выявления антител к гемагглютининам вируса различных подтипов: H5N1, H7N7, H3N8, H1N1, H13N2, H12N5, H2N3, H4N6, H6N2, H8N4, H9N2, H11N6

С целью выявления антител к гемагглютининам вируса других подтипов, а именно H5N1, H7N7, H3N8, H1N1, H13N2, H12N5, H2N3, H4N6, H6N2, H8N4, H9N2, H11N6 исследовали все пробы в РТГА с коммерческими диагностикумами «Диагностические антигены и сыворотки для РТГА»; «Инактивированный антиген вируса гриппа птиц подтипа H5N1», серия №3 контроль№3, дата изготовления 03.2008г., производитель ФГУ «ВНИИЗЖ», Россия.

Данные по выявлению антител к вирусу различных подтипов представлены на рис. 3,4,5.







Рис. 5. Обнаружение положительной реакции (РТГА) с пробами крови кур из 4 –х районов на вирусы подтипов H3, H6, H11, H12,H8, H13.





Обозначения: H3N8, H6N2, H11N6, H12N5, H8N4, H13N2

Наиболее высокие титры антител обнаруживали к вирусу H3N8 в пробах из районов Файзабад, Рашт; к вирусу H6N2 – в пробах из районов: Файзабад, Вахдат, Рашт и Шахринав; к вирусу H11N6 – в пробах из районов Вахдат, Шахринав; к вирусу H8N4, H12N5– в пробах из района Рашт; к вирусу Н13N2 – в пробах из района Шахринав. В остальных случаях антитела не выявляли или выявляли в низких титрах.

Выявление антител у кур к общим поверхностным антигенам гетеротипичных вирусов гриппа лошадей.

В настоящее время установлено, что пандемические штаммы могут возникать путем прямой передачи целого вируса от одного вида к другому. Принимая во внимание, что все штаммы вируса гриппа птиц содержат в своей структуре гемагглютинины лошадиного происхождения, мы провели исследования по выявлению антител у кур к гетерологичным вирусам гриппа лошадей в ИФА со штаммами «А/лошадь1/Прага/56» (H7N7), «А/лошадь2/Маями63» (H3N8), которые содержат в составе антигенных детерминант однотипные для птиц эпитопы. Полученные результаты представлены на рис. 6. Исследование проводили с пробами из районов ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Варзоб, Файзабад, Вахдат, Рашт, Шахринав.



в пробах крови кур из Рушонского района - ГБАО и из района Варзоб выявлены антитела к вирусу гриппа Н7N7 лошадей в высоких титрах. В других пробах уровень антител к вирусу лошадей подтипов H7N7 и H3N8 был минимальный.


ОБСУЖДЕНИЕ

В Таджикистане проблема птичьего гриппа изучена не достаточно. В прошлом на территории Таджикистана были обнаружены штаммы нескольких подтиппов вируса гриппа птиц - 6-й (1972 г.), 7-й (1976-1978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг.).

В настоящее время, несмотря на то, что в сопредельных странах периодически возникают эпизоотии высокопатогенного вируса гриппа птиц (Н5N1), а через территорию республики пролегают основные пути миграции перелетных птиц из Индокитая и Китая, вспышки этой инфекции не регистрируются. Ранее нами (Сайдарова и др. 2009), методом иммуноферментного анализа установлено наличие антител к вирусу гриппа H5N1 у домашних птиц в нескольких областях. Иммунологический мониторинг позволил проследить распространение вируса H5N1, несмотря на отсутствие видимых признаков заболевания у кур. Данные, полученные по районам Вахдат, Рашт, Шахринав свидетельствуют о циркуляции низкопатогенных или авирулентных штаммов вируса H5N1.

Возможность появления как высокопатогенных, так и низкопатогенных вариантов вируса H5N1 обусловлена заносом возбудителя дикими птицами в периоды их осенней и весенней миграций. Высокопатогенные штаммы циркулируют среди птиц в странах Индокитая: Вьетнаме, Лаосе, Камбодже и Таиланде. Именно здесь развивались массовые эпизоотии и эпидемические осложнения птичьего гриппа. Слабопатогенные штаммы H5N1 обнаруживались по периферии этой зоны в Китае, Корее, Казахстане, России, Индонезии, Филиппинах. Кроме того, ранее в птицеводческих хозяйствах республики были выявлены несколько подтипов вируса грипп птиц содержащими гемагглютинины - 6-й (1972 г.), 7-й (1976-1978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг). (Салимов Т.М., Фатхудинова М.Ф. 2008). Исследования на вирус H5N1, проведенные нами в 2006-2009 гг. совместно с сотрудниками Национального центра ветеринарной диагностики и Таджикского научно-исследовательского института профилактической медицины (исследованы 3945 проб сыворотка крови, 51 труп птиц оседлые виды- зимородок, чёрный дроздь, малая горлица, перелётно-гнездящиеся-дубонос, сизый голубь, полевой конёк, зелёная пеночка, комышовая овсянка, обыкновенная овсянка, полевой жаворонок, 226 трахеальных и клоачных мазков от домашних, диких и синантропных птиц), завершились отрицательными результатами. Однако, вопрос, очевидно, нельзя считать закрытым. В Таджикистане наряду с птицеводческими хозяйствами промышленного типа значительное поголовье кур содержится в мелких подворных хозяйствах. Эта птица обычно имеет свободный выгул, и по этой причине возможны множественные контакты с дикими и синантропными птицами - потенциальными носителями патогенных штаммов вируса гриппа). C целью выявления антител к общему типоспецифическому антигену вируса гриппа А (нуклеопротеину), мы исследовали пробы сывороток полученных от кур из районов Вахдат, Шахринав, Файзабад, Рашт используя коммерческий набор «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)», производитель «x-OvO» Великобритания в ИФА. Антитела к типоспецифическому белку гриппа А в достоверно - диагностических титрах были выявлены в пробах, полученных из 4-х административных районов. Наиболее высокие титры антител обнаруживали в районе Шахринав и в более низких титрах - в пробах из других 3-х районов.

Принимая во внимание отсутствие острых вспышек гриппа в популяции кур Таджикистана, обнаружение антител к вирусу Н5N1 могло бы представлять существенный интерес. В связи с этим нами была разработана тест система ИФА для выявления антител к поверхностным антигенам этого вируса.

Наиболее высокие титры антител были выявлены в пробах из района Шахринав, что коррелирует с результатами по выявлению антител к типоспецифицескому антигену гриппа А. Данные, полученные по районам: ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб - по-видимому, объясняются проведённой вакцинацией кур против гриппа и не отражают картину распространения эпизоотического вируса.

Для подтверждения специфичности иммуноферментного анализа с данными пробами применили иммуноблотинг. Для иммуноблоттинга использовали сыворотки крови кур, давшие положительную реакцию на антитела к типоспецифическому белку вируса гриппа А. В качестве дополнительного контроля применяли моноклональные антитела против гемагглютинина Н5 из коммерческого набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA», производство Корея. Результаты показали, что исследуемые сыворотки и специфические моноклональные антитела взаимодействуют с вирусным гликопротеином с молекулярной массой примерно 35 кДт, что соответствует молекулярной массе субъединицы гемагглютинина вируса гриппа.

Следовательно в районе Шахринав в ИФА у кур обнаруживаются антитела к типоспецифическому внутреннему антигену вируса гриппа А и антитела к поверхностнам гликопротеинам вируса. Это означает, что домашняя птица (куры) в этом регионе имела контакт с вирусом H5N1. Наличие у кур специфических иммуноглобулинов к высокопатогенному вирусу HР5N1 при отсутствии манифестной формы инфекции, очевидно, объясняется циркуляцией авирулентных штаммов возбудителя.

Полученные нами данные с вирусом H7N7 гриппа лошадей свидетельствуют об активной циркуляции в популяции кур вируса с гемагглютинином H7 в горных районах ГБАО и Варзоб, что возможно связано с наличием природных резервуаров вируса в дикой фауне этих районов.

Остаётся невыясненным вопрос, существует ли на территории Республики Таджикистан постоянный резервуар этих вирусов, или же они заносятся перелетными птицами.

Исследования, проведенные в РТГА с 12 антигенными подтипами вируса гриппа птиц, позволили установить циркуляцию антител к гемагглютининам подтипов H3N8, H6N2, H11N6, H8N4, H12N5, H13N2. Можно предположить, что распространение слабовирулентных штаммов обусловлено рядом причин. Считается установленным, что домашние водоплавающие птицы (утки, гуси) весьма восприимчивы к эпизоотическим штаммам вируса гриппа, которые распространяются дикими и синантропными птицами (B. Yuksel, Линкольна AMW 2007; A. Globig, Hannover, 2007). Водоплавающие птицы служат резервуаром всех 16 подтипов вируса гриппа типа А. У диких уток вирус гриппа размножается, главным образом, в клетках желудочно - кишечного тракта, инфекция протекает без видимых признаков заболевания, однако, вирус выделяется в высоких концентрациях с фекалиями. Вирус гриппа птиц выделяется из свежих фекальных масс, а также из неконцентрированной озерной воды.

Заражение «дикими» штаммами вируса домашней водоплавающей птицы является тем пусковым механизмом, который служит началом эпизоотических вспышек гриппа среди домашних птиц. Этот механизм хорошо «срабатывает» в странах Юго-восточной Азии (Китай, Въетнам и др.), а также в Европейских странах. В Таджикистане поголовье водоплавающей домашней птицы относительно невелико и это звено не имеет большого значения в эпизоотическом процессе в сравнении с другими регионами.

Ещё одна причина, возможно, заключается в географических особенностях Таджикистана, большая часть которого занята горными хребтами, что затрудняет контакт дикой и домашней птицы. Кроме того, нельзя исключить, что домашняя птица в долинах зонах республики является резервуаром слабопатогенных вирусов гриппа птиц.

Наконец следует принимать во внимание эффективность работы ветеринарной службы страны, которая обеспечивает качественное проведение профилактических и противоэпизоотических мероприятий.


ВЫВОДЫ

1. Проведенными ретроспективными серологическими (иммунологическими) исследованиями сывороток крови кур в нескольких районах Республики Таджикистан в период 2008-2009 гг. обнаружены антитела к различным подтипам вируса гриппа птиц.

2. В реакции торможении гемагглютинации со штаммами 12-ти подтипов вирусов гриппа птиц выявлены антитела к низковирулентным вирусам гриппа птиц подтипов: H3, H6, H8, H11, H12, H13.

3. Для выявления антител к вирусу гриппа H5N1 разработана чувствительная тест – система, непрямой вариант твердофазного ИФА, позволяющая выявлять скрытые очаги гриппа птиц H5N1, в которых не наблюдается манифестная форма инфекции.

4. Исследованием в ИФА (с использованием разработанной нами тест- системы) сыворотки крови кур в районе Шахринав в 62,7 % обнаружены антитела к вирусу гриппа птиц H5N1. Полученные результаты позволяют заключить, что, несмотря на отсутствие в последние годы зарегистрированных вспышек гриппа птиц на территории Республики Таджикистан, в ряде районов циркулируют слабовирулентные штаммы возбудителя.

5. При отрицательных результатах РТГА на вирус H5N1 получены совпадающие положительные результаты в ИФА и иммуноблотинге с использованием моноклональных антител к Н5, производства фирмы «Animal Gеnetics, Inc», Южная Корея.

6. Показано, что вирусы «А/лошадь1/Прага56» (H7N7) и «А/лошадь 2/Маями63» (H3N8) могут использоваться как компонент тест-системы ИФА для

ретроспективной диагностики гриппа птиц подтипов H7 и H3.



ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработано и издано при поддержке представительства ЮНИСЕФ, «Пособие для ветеринарных специалистов для борьбы с птичьим гриппом», Утвержденное Службой Государственного ветеринарного надзора 8 декабря 2007г. (в соавторстве).


СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


1. Diagnostics of equine influenza in elisa / G.K. Yurov, V.V. Ivanov, S.V. Alekseyenkova, M.M. Saıdarova, K.P.Yurov // Proc.10th Internat.Congr. of World Equine Vet. - Ass., 2008, Moscow, p. 696.

2. Иммунологический мониторинг гриппа птиц на территории Республики Таджикистан / М.М. Сайдарова, М. Амирбеков, Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.П. Юров // Иммунология. - 2009. - 30 (5). - С. 309-311.

3. Выявление антител к вирусу гриппа птиц H5N1 методами ИФА и РТГА у кур в птицеводческих хозяйствах Республики Таджикистан / М.М. Сайдарова, М. Амирбеков, Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.П. Юров // Ветеринарная патология. - 2009. - 3. - С. 50-51.

4. Махмадшоев М.М. Пособие для ветеринарных специалистов для борьбы с птичьим гриппом / М.М. Махмадшоев, Н. Тошматов, М.М. Сайдарова // Издание Министерства сельского хозяйства и охраны природы Республики Таджикистан Службы Государственного ветеринарного надзора при поддержке представительства ЮНИСЕФ. - 2007. - С. 1- 89.

5. Аноятбеков М. Зукоми парранда (Грипп птиц) - (на государственном языке) / М. Аноятбеков, М.М. Сайдарова // Ветеринария. - 2010. 7- 9. - Душанбе. - С. 23-27.

6. Ретроспективный анализ циркуляции штаммов вируса гриппа птиц H5N1 на территории Таджикистана методами ИФА и иммуноблотинга / М.М. Сайдарова, М. Амирбеков, Г.К. Юров, С.В. Алексеенкова, К.П. Юров // Кишоварз (Земледелие). - 2011. №1 - С. 14 - 16.



Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconМониторинг инфекционных болезней диких птиц в лесостепной области алтайского края 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconСовершенствование иммунопрофилактики гриппа и болезни Ньюкасла у птиц с применением инактивированных вакцин в сочетании с мирамистином 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconЭпизоотологический мониторинг ящура с использованием гис-технологий 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconКультуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconЭпизоотологический мониторинг и иммунопрофилактика классической чумы свиней и болезни ауески 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconЗначение природных штаммов пастерелл в этиологии пастереллеза овец и коз в хатлонской области республики таджикистан 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconКлинико эпизоотологический мониторинг высокопродуктивных коров в племенных предприятиях свердловской области 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 06.

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconКомплексные мероприятия по профилактике сальмонеллеза птиц в племенных хозяйствах 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconОсобенности распространения, профилактики и лечения парагриппа-3 крупного рогатого скота в республике дагестан 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Ё махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconОсобенности краевой эпизоотологии доминирующих Бактериальных инфекций Сельскохозяйственных животных в республике бурятия 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU