В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных
|
Скачать 283.24 Kb.
|
| В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных, на наследственность. Главные разделы биотехнологии — генная и клеточная инженерия. Методы генной инженерии наиболее детально разработаны на микроорганизмах. Можно направленно изменять их генотип. В отличие от спонтанных мутаций эти изменения можно заранее планировать. Так, в микроорганизмы совершенно определенно встраивают гены, ответственные за синтез интер-ферона, соматотропина, некоторых незаменимых аминокислот. Возможности дальнейшего развития этого направления огромны. Широким фронтом ведутся исследования и разработки по выделению и клонированию определенных генов, их внедрению в геном. Если генная инженерия в микробиологии стала реальностью и приобретает все большее практическое значение, то у животных применение этих методов только начинается, однако установлено, что в принципе можно выделить определенные гены из генома животных и встроить их в геном другой особи. Ген соматотропина (гормона роста) крысы встроен в геном мыши. В результате у некоторых трансгенных животных увеличились скорость роста реципиента и конечная живая масса. Можно себе представить, какое огромное практическое значение будет иметь использование этого приема на сельскохозяйственных животных. Представляется возможным по заранее намеченному плану реконструировать геном домашних животных, придать ему заранее заданные свойства. Для достижения таких результатов традиционными методами потребовалась бы работа в течение многих поколений. Возникает перспективная задача — использовать домашних животных как живые реакторы, ферментеры для производства ценнейших биологически активных веществ. Например, встроив ген интерферона с необходимыми регуляторными элементами в геном коровы, можно рассчитывать, что этот гормон будет экс-прессироваться и в молочной железе. А поскольку активность молочной железы высокая, то можно получать данное вещество с молоком в значительных количествах и, вероятно, при высокой экономической эффективности. Это же в принципе относится и к другим биологически активным веществам. В данном случае молочный скот — оптимальный объект для создания таких живых реакторов. Ни одно другое сельскохозяйственное животное не имеет такого интенсивного синтеза самых разнообразных продуктов и выведения их из организма. Однако существующие методы введения в геном животных инородного генетического материала еще недостаточно совершенны и степень вероятности встраивания чужеродных генов и их экспрессии невелика и исчисляется несколькими процентами и менее. Поэтому необходимо наличие большого числа яйцеклеток для успеха генно-инженерных манипуляций. Установлено, что оптимальной фазой введения инородного генетического материала является стадия зиготы до слияния пронуклеусов. Именно при введении генов в пронуклеус обеспечивается наибольшая вероятность успеха. Следовательно, необходимо иметь большое число яйцеклеток, и уметь их оплодотворять, чтобы уже на фазе зиготы подвергнуть генно-инженерным манипуляциям. В принципе зиготы можно получать от предварительно стимулированных и оплодотворенных животных оперативным путем. Но это очень сложный и трудоемкий способ, связанный с операциями на животных. Поэтому особое значение для развития генно-инженерных работ в животноводстве приобретает отработка методов извлечения из яичников, культивирования, оплодотворения созревших овоцитов in vitro и последующего их раннего развития и трансплантации. Сочетание этих двух методов создает оптимальные условия для широкого внедрения генной инженерии в практику селекционно-племенной работы в животноводстве. По всей вероятности, в ближайшей перспективе методами генной инженерии будут созданы новые формы сельскохозяйственных животных. КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯНаряду с развитием методов генной инженерии в животноводстве перспективны способы клеточной инженерии. В растениеводстве в селекции эти методы уже получили значительное развитие. Культивирование клеток растений in vitro обеспечивает возможность применять системы интенсивного отбора клеток, культивированных в строго контролируемых селективных условиях. Присущие растительным клеткам свойства тотипотентности (свойство отдельных клеток развиваться в целостный организм) дают возможность плюс-варианты регенерировать в целые растения и использовать в процессе селекционной работы. Методы клеточной инженерии перспективны и в животноводстве. Уже накоплен большой опыт культивирования соматических клеток животных in vitro, разработаны оптимальные среды и режимы культивирования, отработаны способы длительного хранения клеток при низких температурах. Как уже было сказано, активные исследования проводятся и по культивированию генеративных клеток. Разработка этих методов создает прочную основу для развертывания теоретических и прикладных работ по клеточной инженерии сельскохозяйственных животных, которые будут иметь все возрастающее народнохозяйственное значение. На первое место следует поставить уже достаточно хорошо разработанный метод разделения ранних эмбрионов. С развитием трансплантации в руках исследователей появилось достаточное количество ранних эмбрионов, что дало мощный импульс работам по манипуляции с этими объектами. Первый успешный опыт по разделению эмбрионов на стадии 2—8 бластомеров был осуществлен Виллардом (Кембридж, Великобритания). Однако получение такого материала связано с большими трудностями и может быть осуществлено в научно-исследовательских учреждениях. В результате исследователи начали манипулировать с эмбрионами в более поздних стадиях развития (морула, бласто-циста). Сущность метода заключается в том, что предварительно вскрывается прозрачная зона (pellucida), эмбрион разделяется на две части. При этом одна половина остается в прежней зоне, а другую переносят в заранее подготовленную зону и производят обычную трансплантацию. Во многих опытах прижив-ляемость разделенных эмбрионов достигает 50—60%. Прикладной аспект этой методики заключается в увеличении числа телят, полученных от каждого донора. По данным американских исследователей, половинки эмбрионов, инкубировавшиеся без прозрачной оболочки, сохраняли жизнеспособность в культуре только в 15% случаев, а при наличии зоны пеллюцида — в 35% случаев. Наилучшие результаты были получены при нехирургическом введении половинок эмбрионов — каждая в отдельной прозрачной оболочке в разные рога матки одного и того же реципиента (55% стельности). В другом опыте были достигнуты еще лучшие результаты при хирургическом введении каждой половинки эмбриона в рог матки на той стороне, где локализовалось желтое тело (65% стельности). Стало очевидным, что разделение эмбрионов — эффективный метод увеличения потомства коров-доноров. В настоящее время эта методика начинает внедряться в практику племенного дела. Уже получены животные от трансплантации половинок эмбрионов свиней (США, Р. У. Роунтри). По данным ряда исследователей, число потомков может быть увеличено на 30—35%. Однако этим не ограничивается значение клеточно-инженерной операции. Возможность массового получения идентичных двоен (генетических копий) очень важна. Эти животные имеют большую ценность для исследователей, занимающихся проблемой взаимодействия генотипа и среды. Использование идентичных двоен позволяет повысить точность исследований и достичь достоверных результатов при меньшем числе подопытных животных. Кроме того, наличие идентичных близнецов позволяет на одном из них проводить изучение признаков, требующих убоя животного (например, мясные качества), и переносить эти данные на близнеца, что является методически вполне обоснованным. Все это позволяет более точно и всесторонне оценить данный генотип. Кроме того, при трудоемкой и длительной работе по оценке быков по качеству потомства эту работу можно проводить только с одним из двойневых идентичных быков. Оценка одного животного будет соответствовать оценке и другого идентичного животного. Имеется информация о том, что уже получено потомство при разделении бластоцисты на 4 части. Это еще в значительной мере увеличивает значение данного метода клеточной инженерии для повышения эффективности селекционно-племенной работы и исследований в области генетики сельскохозяйственных животных. К важнейшим проблемам животноводства относится разра-ботка методов регулирования пола сельскохозяйственных животных. Непредсказуемость пола рождаемых животных может приобретать значительную важность, если экономическое значение животных одного пола существенно выше экономического значения животных другого пола. Пока достигнут лишь незначительный прогресс в решении проблемы контролирования соотношения полов и в разработке методов его регуляции. Идеальным методом контролирования соотношения полов могло бы стать разделение спермиев, несущих Х- и У-хромосомы. Очевидно, именно в этом направлении должны интенсивно развиваться исследования. Другим подходом для воздействия на соотношение полов является определение пола у ранних эмбрионов после извлечения из репродуктивного тракта самки и перед их трансплантацией. Один из аспектов идентификации пола эмбрионов — цитологический, с помощью которого определяют их тип (XX или XY) путем исследования половых хромосом или хроматина. Кроме того, иммуногенетические методы, используемые для идентификации специфичных по полу антигенов эмбрионов, могут быть перспективны для разделения мужских и женских эмбрионов. Количественные различия в метаболической активности мужских и женских эмбрионов могут быть также использованы в качестве принципа для разделения эмбрионов по полу. Имеется сообщение, что с помощью колориметрического теста по определению активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы можно идентифицировать пол. Перспективны методы, основанные на гибридизации ДНК для идентификации мужских эмбрионов. Каждый из указанных способов весьма перспективен. Однако в настоящее время наиболее разработаны и эффективны цитологический и иммунологический методы. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХВажнейшая народнохозяйственная задача — интенсификация животноводства. Поставлена задача резко увеличить уровень производства продуктов животноводства при экономном расходовании ресурсов. Главный биологический фактор интенсификации — генетическое совершенствование животных, основных орудий производства в этой отрасли; повышение их генетического потенциала. В результате планомерной, многолетней работы исследователей и практиков животноводства достигнуты значительные результаты в селекции сельскохозяйственных животных. Генетические методы все в большей степени находят применение в селекционно-племенной работе. Особую роль в повышении эффективности селекционно-племенной работы сыграло внедрение методов популяционной генетики. Разработка и применение методов определения изменчивости, повторяемости, наследуемости и генетической корреляции количественных хозяйственно ценных признаков позволили точно прогнозировать и планировать селекцию на них. Популяционная генетика стала теоретической основой системы крупномасштабной селекции, которая интегрировала самые новейшие достижения в этой отрасли генетики, методы искусственного осеменения и длительного хранения гамет сельскохозяйственных животных, а также современные способы сбора, хранения и анализа генетической информации с использованием современных ЭВМ. Широкое использование крупномасштабной селекции прежде всего в молочном скотоводстве, а затем и в других подотраслях животноводства позволило резко ускорить темпы генетического совершенствования разводимых в стране пород сельскохозяйственных животных. Возможности этой системы далеко не использованы, и она будет все шире внедряться в практику племенного дела. Вместе с тем у этой системы, основанной на методах генетики популяций, имеются и ограничения. Так, поиск быка-улучшателя основан на оценке по потомству большого числа производителей. А это связано с большими затратами, поскольку быки-улучшатели — явление редкое, а выдающиеся — чрезвычайно редкое. Кроме того, ряд селекционных программ, направленных на выведение животных, невосприимчивых к некоторым заболеваниям (лейкоз, мастит), пока не дают существенных сдвигов. Поэтому селекционеры сельскохозяйственных животных все чаще обращают внимание на клеточную и генную инженерию. Один из методов клеточной инженерии — трансплантация ранних эмбрионов, получение идентичных близнецов, химерных животных — уже широко внедряется в практику селекции сельскохозяйственных животных и ускоряет генетическое улучшение пород. С 50-х годов до настоящего времени разработаны методы генетического манипулирования, которые сложились в четкую систему генной инженерии животных. К этим работам относится пересадка клеточных ядер у лягушек методом микроинъекции Бригса и Кинга. В настоящее время перенос ядра соматической клетки в энуклеированную зиготу успешно проведен на мышах. Освоен метод переноса ядра путем слияния кариопластов. Разработана методика получения химер у млекопитающих. Гарднер разработал методику инъекции бластомеров в бластоцисты реципиента. Эта методика освоена на мышах Бутлером. На ее основании получены химеры у овец. Указанные работы, связанные с клеточной инженерией животных, подготовили подходы к генной инженерии сельскохозяйственных животных. Один из методов получения трансгенных животных заключается в переносе генов в культивируемые клетки, а затем их инъ-ецировании в бластоцисту. Разработаны различные методы внесения генов в генотип реципиентных клеток. Наибольшее распространение в последнее время получил метод инъецирования чужеродных генов в пронуклеус зиготы животных. Впервые инъецирование было проведено на ооцитах лягушек: в яйцеклетки вводили определенную ДНК, и были отмечены интеграция и транскрипция. В 1981 г. был инъецирован ген ^-глобина кролика в зиготу мыши. Ген, включенный в геном, имел вид длинного тандема организованных участков, которые корректно транскрибировались только в том случае, если они не содержали плазмидных компонентов (Т. Е. Wagner и др.). Проявление действия встроенных генов, введенных путем микроинъекции, изучали на мышах. На ряде генов установлено их тканеспецифическое действие в зависимости от регуляторных элементов того или иного гена. В 1980 г. в пронуклеус зиготы мыши была инъецирована плазмида pBR322, содержащая вставку генов вирусов SK40 и HSV. У трех мышей (3,8%) из 78 найдена ДНК, что подтвердило хромосомную интеграцию, однако ДНК подверглась реорганизации. При инъецировании гена -глобина человека в комплексе с геном ТК HSV в пронуклеусы зигот мыши установлена интеграция у пяти из 33 плодов (15,1%), извлеченных на 16—17-йдень. Проведена микроинъекция в пронуклеус зиготы гена -глобина кролика, экспрессия наблюдалась у пяти мышей. Бринстер и др. инъецировали в пронуклеусы зигот мышей комплекс, включающий металлотионеин мыши с геном тими-динкиназы с промотором, интеграция была отмечена у семи из 41 мыши (17%), экспрессия наблюдалась у четырех особей. Наиболее активная экспрессия отмечена в печени и почках. Революционные достижения в биологии, особенно в генетике, позволили создать принципиально новые биотехнологии, генетическая инженерия стала признанной, перспективной технологией. В середине 70-х годов были открыты микробные ферменты, позволяющие разрезать молекулы ДНК в совершенно определенном месте, то есть выделять нужные ее участки, что позволило искусственно сливать гены или создавать рекомбинантную ДНК. Стало возможным идентифицировать и клонировать определенные гены. Выбранный ген должен иметь какую-либо биологическую функцию, которая может быть детектирована. Выделенный ген должен быть введен в ДНК-молекулу переносчика или вектора — посредника при переносе гена. Таким образом, ген может быть перенесен из организма донора в организм реципиента, который впоследствии будет в состоянии реплицировать чужеродный ген. Следовательно, чужеродный ген в организме реципиента будет не только действовать, но и реплици-роваться. Генная инженерия в основном состоит из выделения из одного организма гена (ДНК), определяющего желательный признак, и переноса его в другой организм, который получает новый генетически наследуемый признак. Современная биотехнология создает возможность передачи отдельного гена или блока генов, контролирующих определенный признак. Такой ген может быть перенесен из любого организма в любой другой организм. При этом в новом организме он будет, вероятно, способен проявлять свойственную ему экспрессию, то есть проявляться в фенотипе. При этом организмом-реципиентом может быть как растительная, так и животная форма. Использование биотехнологии в селекции животныхПараллельно с генной инженерией разработан ряд других направлений биотехнологий. Одно из них — трансплантация оплодотворенных яйцеклеток и ранних эмбрионов. Этот метод успешно применяется в работе с крупным рогатым скотом начиная с 1951 г. Его используют для получения потомства от наиболее ценных животных. Метод трансплантации эмбрионов стал одной из технологий генетической инженерии в работе с животными. Первым шагом в этом плане стала успешная трансплантация оплодотворенных яйцеклеток, в ядро которых был введен чужеродный ген путем микроинъекции. Опыты на лабораторных животных быстро переросли в технологии, практически применяемые уже на практике. Для получения рекомбинантных продуктов используют бактерии, грибы и все чаще клетки животных. Это позволяет получать искусственным путем белки, которые в норме продуцируются только животными. Нужные гены были перенесены в соответствующие организмы, в которых и проявляли экспрессию . Этот метод широко используется в медицине и ветеринарии. В качестве примера можно привести ренин, используемый в сыроварении. Широки возможности получения таким путем и ферментов, используемых для изготовления моющих средств и в приготовлении пищи. В настоящее время исследования направлены на создание системы ферментов для получения глюкозы из целлюлозы. Гены, контролирующие выделение ферментов, которые обнаружены у медленнорастущих грибов, были клонированы и перенесены в быстрорастущие бактерии и дрожжи. Это позволило создать эффективную технологию получения из целлюлозы древесины легкопереваримых углеводов. Проводятся работы по получению ферментов, участвующих в гидролизе лигнина, что позволяет создать технологию его расщепления на более простые молекулы, а это в дальнейшем даст возможность получать биогаз или одноклеточный протеин. Это может стать основой технологии обработки грубых, целлюлозсодержащих кормов (биомасса и т. д.). Развернуты работы по получению трансгенных животных. Установлено, что мышь из трансплантированной яйцеклетки может иметь одну копию гена гормона роста или несколько таких копий в своих хромосомах. Гормон роста программируется геном, стимулирует рост организма и определяет конечный его размер. Гены, контролирующие образование гормона роста (как крысы, так и человека), уже изучены при введении в организм мыши. Все это указывает на реальную возможность использования методов генной инженерии при работе с высшими животными. Такая технология разрабатывается. При этом в первую очередь следует использовать гены, контролирующие интенсивный рост животных и эффективную их продуктивность. Исследователи этой проблемы нередко сталкиваются и с нежелательными последствиями введения чужеродного гена, в частности с потерей фертинга. Генная и клеточная инженерия широко используются в ветеринарии. Большие потери при воспроизводстве скота и птицы вызываются различными заболеваниями. Особенно большой ущерб наносят инфекционные заболевания. Для борьбы с рядом болезней успешно применяют различные вакцины. Методами генной инженерии можно получить такие вакцины, которые невозможно получить традиционными методами. Эти вакцины могут быть более безопасными, дешевыми и стабильными по сравнению с существующими. Иммунная реакция — мощный защитный механизм у животных. При попадании в организм чужеродного белка определенные клетки продуцируют антитела, призванные нейтрализовать его. Установлено, что определенная часть молекулы протеина является антигенной детерминантой. При помощи рентгенографии и кристаллографии можно не только увидеть структуру белка, но и установить локализацию антигенной детерминанты. Возможность наблюдать трехмерную структуру антигенного сайта уже позволяет синтезировать полипептидную структуру, которая может служить в качестве синтетических антигенов для использования в вакцинации. Гены, контролирующие образование таких полипептидных антигенов, могут быть синтезированы и введены в клетки, которые будут в массе продуцировать антигены. Важнейшая биотехнология для ветеринарии — гибридомная. Путем инъекции антиген вводят мыши. Клетки костного мозга мыши, продуцирующие антитела, сливаются (смешиваются) с клетками, способными расти в культуре (миеломные клетки). В результате гибридные клетки продуцируют антитела. Эти клетки можно клонировать. Клеточную линию, продуцирующую желательные антитела, отбирают, и в постоянной культуре она становится источником антител. Этот метод используют для идентификации антигенных белков, а также специфических антигенных сайтов, определяющих образование антител. В настоящее время эти технологии получают все большее развитие. Развитие методов биотехнологии животныхВ отношении сложнообусловленных полигенных количественных признаков, к которым относятся большинство хозяйственно ценных показателей сельскохозяйственных животных,, в селекции применяются методы популяционной генетики. Методы определения изменчивости, повторяемости, наследуемости количественных признаков, генетических корреляций между ними положены в основу современной крупномасштабной селекции. Все это дает возможность точно планировать селекционно-племенную работу по улучшению количественных признаков. Широкое использование информатики и ЭВМ позволяет создать базу для оперативного анализа генетической информации в огромных по численности популяциях сельскохозяйственных животных. Все это значительно ускоряет темпы генетического улучшения разводимых в стране пород, активизирует процессы выведения новых линий, типов и пород животных. Генная инженерия представляет собой логическое продолжение развития и применения новейших генетических методов в селекции животных. Возможности генной инженерии увеличились в связи с открытиями в области регулирования действия генов. Инъекция клонированного гена ростового гормона человека свиньям и овцам стала возможной в результате двух новых методов биотехнологии — микрохирургии на эмбрионах и рекомбинации ДНК. Микрохирургия на яйцеклетках и эмбрионах и рекомбинация ДНК в принципе открывают возможность более интенсивной селекции животных. Сочетание генетического манипулирования с уже широко распространенными методами / длительного хранения спермы и эмбрионов дает селекционеру/ невиданные возможности более эффективной селекции. Основные методы генной инженерии животныхУспех генной инженерии на животных зависит от возможности вставок генов (представляющих интерес) в геном. Два метода открывают большие возможности для вставки клонированных генов в ядро клетки: перенос генов в пронуклеус и вирусная трансфекция. Перенос генов с ДНК- Установлено, что инфекционность ДНК аденовируса 5 в однослойной культуре клеток KB человека может быть значительно повышена путем преципитации вирусной ДНК с помощью фосфата кальция. Метод оказался эффективным и для других ДНК. Используя перенос генов с помощью ДНК, Виглер и другие смогли перенести ДНК, включающую ген тимидинкиназы (ТК), выделенный из вируса герпеса (HSV-1) в культивированные клетки мыши, в которых тимидинкиназа отсутствует. Полученные в результате этого клоны, содержащие вирусную тимидинкиназу, стабильно поддерживались в течение ряда поколений. Поскольку эффективность трансфекции ДНК с фосфатом кальция невелика, то для отбора клонов клеток, трансформированных по тимидинкиназе, была использована среда HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клетки, не прошедшие трансформацию, не имели ТК, поэтому после трансформации их можно было элиминировать (отбросить) и культивировать в среде, содержащей HAT. Выжили только клоны с функциональной ти-мидинкиназой. Для селекции можно использовать свойство устойчивости к определенным веществам, например неомицину. Вирусная инфекция. Вирусная инфекция — естественный путь введения генетической информации в клетки (животных). Кроме того, вирусы используются для трансформации клеток с ценными генами. Проведена работа по инъекции ДНК вируса 5V40 в бластоцель мышиных эмбрионов и пересадке трансформированных эмбрионов в матку псевдобеременных мышей. Эта ДНК обнаружена у 25 из 29 мышей, полученных из 80 инъецированных эмбрионов. Анализ на гибридную ДНК показал, что 10 мышей были носителями ДНК вируса SVO. Вирусная ДНК была неравномерно распределена по тканям, вероятно, в связи с неодинаковым уровнем инфицирования клеток внутренней клеточной массы или в результате гибели некоторых линий эмбриональных клеток, несущих вирус, в процессе развития. Показано, что мыши, зараженные вирусом лейкемии Молони на стадии 4—8 клеток, стабильно содержали одну копию вируса в своем геноме. Вирус передавался потомству как менделевский доминантный признак. Мыши II поколения были заражены и поражались лейкемией. Проявление вируса у взрослых животных варьировало: у некоторых линий мышей развивалась ранняя лейкемия, а у других заболевание развивалось в более позднем возрасте. Одно из возможных последствий внедрения гена с применением любых способов — образование вставочных мутаций, то есть изменений в функции собственного гена в результате вставок чужого гена в него или около него. Одна линия мышей, трансформированных вирусом лейкемии Молони, не могла быть доведена до гомозиготности. В результате ранней эмбриональной смертности гомозиготных эмбрионов продукт полного доминирования гена в процессе развития отсутствовал. Получение мутантов путем вставок открывает огромные возможности для генетических исследований. Данные об использовании ретровируса для трансформации клеточных линий млекопитающих по функционально неселектируемому гену в литературе не встречаются. Однако Миллер и другие описали синтез поддающегося селекции ретровируса, содержащего миниген, контролирующий ростовой гормон крысы, который может инфицировать культивируемые клетки и обусловливать выработку большого количества ростового гормона. Вставка вирусов в клеточный геном происходит в одном месте без перестройки. Было установлено, что изменение характера проявления действия гена обусловлено первоначальным местом его встройки, а не последующей модификацией. В настоящее время разработаны системы различных ретро-вирусных векторов, обеспечивающие надежные трансфекции чужеродных генов в организм птиц и млекопитающих. Таким образом, с учетом сложности генома животных, а также наличия взаимодействия генов в ряде случаев эффект вставки гена будет проявляться не в чистом виде, а сопровождаться другим, иногда не контролируемым пока изменением генома. По-видимому, огромную роль здесь может играть и так называемый эффект положения гена, то есть воздействие внедренного гена будет во многом зависеть от его локализации в геноме реципиента. Имеются данные о том, что вирусы саркомы Молони у мышей могут быть использованы для инфицирования клеток эмбриональной карциномы, которые способны к самостоятельному размножению, как и клетки эндодермы эмбрионов мышей» в результате чего вирус, находившийся в клетках в большом числе копий, не проявлял своего действия вследствие метилирования. Однако, если ДНК вводилась в дифференцированную , клетку, действие гена проявлялось. Существуют и другие, не вирусные, элементы, которые могут служить носителями при переносе генов. Это так называемые мобильные элементы. В 1983 г. была изолирована и описана ДНК мобильных Р-элементов из дрозофилы. Эти элементы иногда образуют вставки в геноме дрозофилы. Они могут быть вырезаны с большой точностью, после чего мутировавший в результате вставки ген снова начинает проявлять свое действие. При инъекции ДНК предполагаемого Р-элемента задней стороны яиц мух типа М перед самым образованием полярных клеток отмечалась высокая степень мутабельности в отдельном локусе, который контролирует морфологию волосков и щетинок на кутикуле взрослых мух. Появление мутантных линий можно было демонстрировать гибридизацией in situ, при которой проявлялось включение ДНК Р-элемента. Включенные в геном Р-элементы не содержали ДНК дрозофилы, которая присутствовала в оригинальном гибридном материале или в участке плазмиды-носителя pBR 322, что доказывает транспозицию элемента Р в геном. Затем Рубин и Спрадлинг осуществили соединение гена, контролирующего ксантиндегидрогеназу, и инъецировали эту конструкцию в эмбрионы. Взрослые мухи передали своему потомству признак розовой окраски глаз, и таким образом была доказана наследуемость гена. Ученые предложили две модификации ДНК элемента Р для того, чтобы сделать его более пригодным в качестве носителя: включение большого числа сайтов рестрикции в этот элемент и создание аномального Р-элемента, кодирующего транспозазу, но не включаемого в геном. Р-Элементы были использованы для вставки»различных генов в геном дрозофилы, в частности, допа-декарбоксилазы и спиртовой дегидрогеназы. Оба гена проявляли свое действие на соответствующих стадиях развития, причем в тех тканях, в которых этот ген обычно проявляется. Наиболее широко для введения генов используется микроинъекция. Весьма совершенным методом, используемым в последнее время для изучения проявления действия генов, является микроинъецирование в пронуклеус зиготы. Впервые инъецирование было проведено на ооцитах лягушки Xenopus laevis, в которые вводили хорошо известную ДНК. В 1975 г. Кол-ман ввел в яйцеклетки и ооциты X. laevis ДНК клонированные гены и наблюдал проявление их действия, чтобы изучить, присутствует ли механизм переноса и в ооцитах, и в яйцеклетках. Установлено, что транскрипция рекомбинантной ДНК происходила в обоих случаях. Было показано, что ооциты X. laevis могут транскрибировать рекомбинантные ДНК вполне эффективно, если ДНК вводится в зародышевый пузырек. В 1981 г. осуществлено инъецирование гена -глобина кролика в оплодотворенные яйцеклетки X.Laevis. Генная инженерия и воспроизводство животныхК важнейшим хозяйственно ценным признакам сельскохозяйственных животных относятся воспроизводительная способность, плодовитость. Совершенно очевидно, что эти процессы находятся под строгим генетическим контролем, который осуществляет гормональный статус организма, непосредственно влияющий на показатели воспроизводства. Установлено влияние ряда гормонов (ФСГ и ЛГ) на функцию воспроизводства. Стало принципиально возможным методами генной инженерии организовать биотехнологическое производство этих гормонов для регуляции и стимуляции функций воспроизводства, осуществления работы по трансплантации ранних эмбрионов. В этой связи представляет интерес изучение гена овец породы бурула, который является геном, прямо влияющим на функцию яичника овцы. Бурула — одна из небольшого числа мериносовых пород овец, с высокой генетической обусловленной способностью к высокой плодовитости. Порода представляет большую ценность в качестве генетического улучшателя (путем скрещивания) овец других мериносовых пород в отношении увеличения (40— 60%) их плодовитости. При традиционной внутрипородной селекции по этому признаку такой эффективности можно достичь примерно в течение 30 лет. Плодовитость овец относится к полигенным признакам, на которые оказывают влияние многие гены. Высокая плодовитость овец бурула — вероятно, следствие влияния одного гена (F), который воздействует на число овулируемых яйцеклеток из яичника за каждый цикл течки. Этот факт возродил интерес к изучению роли основных генов (оли-гогенов) в развитии количественных признаков животных и к развитию методов их распознавания и использования. Животные — носители бурулагена — уже были использованы для генетического улучшения эффективности воспроизводства овец. Ген F ввели в геном животных других пород овец путем скрещивания и разработали точные математические модели для прогноза возможной эффективности этих программ. Технология рекомбинантной ДНК во многом может упростить этот процесс и сделать возможным пересадку гена F не только в геном овец, но и других видов сельскохозяйственных животных. Поэтому обзор данных о бурулагене представляет большой интерес для практической генной инженерии сельскохозяйственных животных. Изучение межлинейных кроссов показало, что повышение плодовитости — результат скрещивания бурула с другими мериносами, а также с различными другими породами овец. Однако не всегда повышение плодовитости можно отнести к эффекту только одного гена. Из многих работ, посвященных оценке сравнительной продуктивности помесей бурула с овцами других пород, только п одной выявлен эффект F-гена на шерстную продуктивность и живую массу тела. В этой работе было показано, что ген не оказывает нежелательных плейотропных действий на настриг шерсти, толщину и длину волокна, массу новорожденных ягнят, живую массу взрослых (15-месячных) овец. Эти данные подтверждают, что принципиальный эффект гена — влияние на плодовитость в результате воздействия на степень овуляции, в частности число потомков овец с генотипом FF, — был в 1,9 раза больше. Исследования биологии размножения овец бурула подтвердили, что роль F-reiia направлена на контроль физиологии яичника овец. Установлено, что овцы бурула имеют одинаковое с контрольными мериносами число развивающихся фолликулов. У овец романовской породы в 2 раза больше развивающихся фолликулов, чем у овец других пород. В пределах популяции бурула (степень овуляции от 3 до 9) не было корреляции между степенью овуляции в предшествующем цикле и числом антральных фолликулов. Эти данные подтверждают, что яичник овцы бурула имеет отличие в фолликулярных характеристиках от других плодовитых пород. Стало очевидно, что F-ген не влияет на увеличение числа развивающихся в яичнике фолликулов. Степень ат-резии среди развивающихся фолликулов также влияет на сходство овец с -геном и не несущих его. Однако овцы породы бурула характеризуются наличием фолликулов, которые имеют значительно меньшие размеры к моменту овуляции, а также тем, что они содержат только 50% числа гранулированных клеток в каждом развивающемся фолликуле; эти морфологические признаки" могут быть отнесены непосредственно к эффекту F-гена. Различия в развитии и морфологии фолликулов в такой же степени, по-видимому, обусловливают высокую степень овуляции у бурула. Было отмечено, что у бурула фолликулы диаметром менее 2 мм появлялись между 13-м и 15-м днями цикла и они достигали овуляционного размера (3—4 мм) на 15-й день. Однако пополнение продолжалось в течение 15—17 дней, и дополнительные фолликулы у бурула достигали овуляционного размера ко времени высвобождения лютеинизирующего гормона (ЛГ). Этого явления не отмечали у романовской породы, и оно характерно только для овец породы бурула. Таким образом, два генотипа мериносов (то есть бурулаи контроль) начинали лютеолизис с небольшим числом кандидатов (то есть антральных фолликулов) для овуляции. У контрольных мериносов часть «доминантных» фолликулов быстро развиваются, а остальные прекращают развитие и атрезируют. У бурулы дополнительные кандидаты не исключаются, и их развитие до конечной стадии роста фолликулов и овуляции индуцируется повышенной частотой выброса ЛГ. Время предовуляторного высвобождения ЛГ у плодовитых овец — важный признак. В исследованиях на плодовитых овцах с генотипами, отличающимися от генотипа бурула, было показано, что у них высвобождение ЛГ отмечалось значительно позже после начала течки (и лютеолизиса), чем у овец с низкой плодовитостью. У овец бурула этого не происходит, так как оба генотипа и «С»-мериносы высвобождали ЛГ приблизительно через 4, 5 ч после начала течки. У овец бурула овуляция отмечается в среднем на 7,5 ч раньше после начала течки по сравнению с контролем, несмотря на одинаковое время высвобождения ЛГ. Ген F, по-видимому, делает предовуляци-онные фолликулы более чувствительными к эндогенному ЛГ. Имеются данные, свидетельствующие о том, что овцы бурула, не достигшие половой зрелости, и взрослые имеют в плазме более высокие концентрации ФСГ, чем контрольные мериносы. Это различие было также подтверждено в отношении гипофиза с помощью метода радиорецептора и радиоиммунного теста. Можно заключить, что множественная овуляция у овец — результат интенсивной ФСГ-стимуляции яичника в течение поздней лютеиновой и ранней фолликулярной фаз цикла течки. Активность яичника овцы бурула, вероятно, не зависит от концентрации гонадотропина в плазме, а связана с повышенной чувствительностью к гонадотропину фолликулов этих животных. Это утверждение основано на том, что овца бурула проявляет более высокий овуляторный ответ на гонадотропин СЖК (ГСЖК), чем мериносы, и что овцы с F-геном более чувствительны к ГСЖК, чем овцы без F-гена. Различие в чувствительности было явным начиная с 5-месячного возраста овец. Это может быть основным признаком генотипов плодовитых животных, поскольку генетические связи между плодовитостью и чувствительностью к ГСЖК описаны также у мышей и крупного рогатого скота. Пока не установлено — яичник или индивидуальные фолликулы плодовитых пород более чувствительны к ФСГ — гормону, отличающемуся от экзогенного ГСЖК. Такие данные могут быть получены, при исследовании ответа изолированных фолликулов на добавление ФСГ или ответа яичника гипофизэкто-мированных овец на введенный овечий ФСГ. Такие эксперименты проводятся. Если фолликулы овцы бурула имеют больше рецепторов к гонадотропину, то они могут затем больше захватывать гонадотропина из циркулирующей крови, чем фолликулы других мериносов. Этим можно объяснить различия в чувствительности яичника между генотипами. Приобретение рецепторов к ЛГ на гранулированной оболочке — существенная необходимость для овуляции развивающихся фолликулов овцы. У овец финский ландрас таких фолликулов в фолликулярную фазу больше, чем у овец породы суффольк. Однако нет данных, что плодовитая овца имеет больше рецепторов к ЛГ на каждом фолликуле. Можно предположить, что добавочные фолликулы, которые развиваются у овец бурула, образованы так в результате наличия у них рецепторов к ФСГ (или большого числа рецепторов к ФСГ), что делает их способными отвечать на этот гонадотропин. Было сделано заключение, что фактор яичника, отличный от эстрадиола и прогестерона, должен способствовать регуляции обратной связи ФСГ в течение цикла течки у овец. Фактор яичника,— по-видимому, ингибин, нестероидный гонадный гормон, способный селективно угнетать выделение ФСГ из гипофиза. Несмотря на то что в настоящее время ингибин очищен, данные о его влиянии на плодовитость основаны главным образом на экспериментах с использованием фолликулярной жидкости (ФЖ), свободной от стероидов. Установлено, что в ФЖ имеются другие белковые гормоны, которые могут непосредственно действовать на яичник. Свободная от стероидов овечья ФЖ способна подавлять течку и овуляцию у бурула и мериносов. Повторяющиеся инъекции овечьей ФЖ в течение 5 дней задерживают овуляцию, по крайней мере, на 12 дней. Частично очищенная овечья ФЖ была эффективна в такой же степени, как и неочищенная овечья ФЖ в подавлении овуляции. Этот эффект, по всей вероятности, результат действия ингибина в овечьей ФЖ, поскольку последняя селективно подавляет ФСГ у овцы. Доказательство включения ингибина в действие /-'-гена получено путем измерений его биоактивности у овец бурула и мериносов. У овец бурула. со средней степенью овуляции 2,8 содержалось '/з ингибина по сравнению с мериносами, у которых было в среднем 1,2 овуляции. Изучение ингибина в яичнике бурула позволило определить связь между этим гормоном яичника и плодовитостью. Косвенно эта связь доказывается повышением степени овуляции, которое отмечается у мериносов после активной иммунизации против ингибина. Это было впервые описано у мериносов в 1982 г. и затем подтверждено "в исследованиях на овцах другой породы. Наблюдалось достаточно эффективное повышение степени овуляции у иммунизированных животных. У них выявляли потерю регуляторного контроля функции яичника, которая проходила по такому же пути, как и у бурула. Так, ягнята-мериносы, иммунизированные против ФЖ крупного рогатого скота с третьей недели жизни, раньше достигали половой зрелости, и у них повышалось число овуляций (до 8). Следовательно, недостаток ипгибина яичника может иметь ключевое значение в высокой степени овуляции у бурула, опосредованной, вероятно, с помощью повышенной концентрации ФСГ в течение течки. Наличие изменений в фолликулах бурула, включая снижение популяции гранулированных клеток, согласуется с недостатком ингибина, местом синтеза которого являются эти клетки. Ускорение полового созревания и повышение степени овуляции у нормальных мериносов, иммунизированных против богатой ингибином фракции ФЖ крупного рогатого скота, — дополнительные косвенные доказательства этой гипотезы. Хотя ингибин — белок яичника, селективно регулирующий секрецию ФСГ с помощью влияния по принципу обратной связи на систему гипоталамус — гипофиз, имеются веские основа- кия предполагать о наличии интраовариалыюго регулирующего вещества, которое может включаться в процессы овогенеза. Было показано, что свободная от стероидов фолликулярная жидкость содержит вещество (фактор, ингибирующий развитие фолликула), которое ингибировало фолликулярный ответ у хронически гипофизэктомированных овец на введение 2250 ME ГСЖК. Этот ингибитор роста фолликулов не мог быть ипгибином, но, вероятно, оказывал местное воздействие внутри фолликула яичника, прерывая митотическое деление гранулированных клеток. Указанное предположение позволяет объяснить, как у овец основные, или доминантные фолликулы среди фолликулов — кандидатов для овуляции — могут секретировать вещество, которое локально подавляет развитие других кандидатов. Наиболее важная задача — установить, имеет ли яичник овец бурула такой же дефицит ингибитора развития фолликулов, как и для ингибина. Возможно, у овец имеется развитая двойная система регулирования. Таким образом, у овец всех пород наступает фолликулярная фаза нового цикла течки с избытком фолликулов, способных овулировать (суперовуляция у некоторых овец, подтвержденная с помощью ГСЖК или ФСГ). После лютеолизиса у нормальной овцы, когда начинается развитие фолликулов, | продукция ингибина снижает обеспечение ФСГ в такой степени, что новые фолликулы не могут начать развитие. В это же время, в качестве гарантированного предупреждения развития доминантные фолликулы продуцируют ингибитор роста фолликулов, который исключает возможность начать развитие дополнительных фолликулов с помощью деления гранулированных клеток. При этом также должно обеспечиваться сохранение уровня продуцируемого ФСГ для дополнительных фолликулов. Периферические концентрации эстрадиола незначительно отличаются у овец бурула и мериносов в течение цикла течки. Концентрации эстрадиола в кровеносных сосудах яичника аналогичны таковым у овец, имеющих -ген, так и не имеющих его. Очевидно, особые фолликулы, которые полностью развиваются и овулируют у овец бурула, не секретируют дополнительный эстроген. Возникло предположение, что различие в чувствительности к отрицательной обратной связи, обусловленной стероидами, может быть ответственным за высокую степень овуляции у плодовитых овец финский ландрас. Установлено, что при угнетении отрицательной обратной связи ЛГ с помощью эстрадиола у овариэктомированных овец бурула и мериносов оба генотипа имели одинаковую .чувствительность. Особенность лютеиповой функции у овец бурула заключается в том, что концентрации прогестерона в плазме на 9—11-й день с начала течки не повышаются с увеличением степени овуляции, что резко контрастирует с тем явлением, когда степень овуляции повышалась с помощью ГСЖК. Основа этого явления неизвестна, хотя, по-видимому, это результат пониженной массы индивидуального желтого тела у овец бурула. Бурула-мериносы — наиболее интересная генетическая модель плодовитости у овец. Приведенные данные показывают, что эти животные имеют уникальный генотип. Практическое значение F-reiia заключается в значительном его действии на плодовитость. Поэтому он может быть использован для быстрого повышения у овец эффективности воспроизводства. Действие копии гена сравнимо с эффектом многолетней внутрипородной селекции на величину приплода или степень овуляции. Открытый ген F бурула в принципе может быть выделен, клонирован и введен в геном других сельскохозяйственных животных, что позволит существенным образом улучшить их воспроизводительную способность. Перспективно также выделение генов, определяющих синтез ряда гормонов, связанных с регуляцией процессов воспроизводства, и введение их в геном животных. Следовательно, и в этой области генной инженерии открываются большие перспективы для селекции сельскохозяйственных животных. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
|
Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка: 