Микоплазмы и микоплазмозы человека icon

Микоплазмы и микоплазмозы человека





НазваниеМикоплазмы и микоплазмозы человека
страница4/4
И.В.Раковская
Дата конвертации22.07.2013
Размер0.78 Mb.
ТипЛитература
1   2   3   4

Диагностика микоплазменных инфекций (6, 7,11).


Ввиду того, что микоплазменные инфекции не имеют каких-либо специфических, свойственных только им клинических проявлений, для их выявления необходимо использовать методы лабораторной диагностики. Используют 3 группы методов:

1) Культуральные методы;

2) Иммунологические методы выявления антигенов микоплазм и антител к ним

3) Молекулярно-биологические методы.


Исследуемый материал.

При подозрении на респираторный микоплазмоз исследуют мазки из носоглотки, лаважную жидкость, мокроту, бронхиальные смывы, а также мазки-отпечатки тканей органов мертворожденных и абортированных плодов.

При урогенитальных инфекциях исследуют срединную порцию утренней мочи, соскобы со слизистой уретры, сводов влагалища, цервикального канала, материал, полученный при лапароскопии, амниоцентезе, мазки-отпечатки органов абортированных и мертворожденных плодов. При простатите исследуют секрет простаты, при мужском бесплодии - сперму

При заборе материала соблюдают те же правила, что и при исследовании на хламидиоз.


Культуральные методы. Для всех видов микоплазм и уреаплазм необходимы стеролы (холестерин и его производные) и жирные кислоты. Потребность в стеролах очень редко наблюдается у прокариот, мембраны которых их, как правило, не содержат. Микоплазмы нуждаются также в фосфолипидах, гликолипидах и фосфогликолипидах. Источником этих соединений является сыворотка крови животных, для большинства микоплазм - сыворотка крови лошади. Виды, ферментирующие глюкозу, лучше растут при более высоких значениях рН (8 - 8,5). Виды, гидролизующие аргинин и мочевину - при более низких значения рН (6,5 - 6,0). Требования к аэрации у разных видов различны. Большинство видов лучше растут в атмосфере газовой меси, состоящей из 95% N2 и 5% СО2 .

Микоплазмы можно культивировать на жидких, полужидких (0,3% агар) и плотных (1,3% агар) средах. Некоторые виды микоплазм (М. pneumoniae, M. genitalium) можно также выращивать на стекле и пластике в виде монослоя, как культуру клеток.

Большинство видов микоплазм размножаются медленно, культивирование продолжается несколько дней или даже недель (М. pneumoniae, M. genitalium). Кривая их роста в основном сходна с кривой роста бактерий. М. hominis достигает конца логарифмической или начала стационарной фазы роста только через 48 - 72 часа, титр клеток в популяции составляет к этому времени 10 - 10 КОЕ/мл. Такой титр сохраняется в стационарной фазе роста в течение 5-7 дней культивирования. Уреаплазмы имеют очень короткую стационарную фазу, их жизнеспособность резко падает уже через 24 ч. реже - 48 ч., когда погибает приблизительно 90% клеток, особенно в плохо забуференной среде.

Бульонные культуры микоплазм слегка опалесцируют, уреаплазмы не вызывают помутнения среды даже при титре 10' КОЕ/мл. В толще полужидкого агара микоплазмы и уреаплазмы образуют светлое облачко по ходу укола пипетки, особенно хорошо заметное в проходящем свете.

На полутвердом агаре микоплазмы образуют колонии 0,1 - 0,3 мм в диаметре, либо равномерно зернистые, либо по форме похожие на яичницу-глазунью. Колонии уреаплазм имеют диаметр 0,01 - 0,03 мм. Колонии микоплазм, и тем более уреаплазм видны только при малом увеличении микроскопа (х100).

При выращивании на питательных средах микоплазмы проявляют чрезвычайно высокую требовательность к их составу и условиям культивирования, особенно это относится к патогенным микоплазмам, которые культивируются с большим трудом.

Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

1. Они должны содержать все предшественники, необходимые для синтеза макромолекул, что обеспечивается использованием вытяжки из говяжьего сердца и мозга, пептона, дрожжевого экстракта как источника фактора роста, ДНК, либо НАД (никотинамид-аденин-динуклеотид), либо ДПН (дифосфопиридиннуклеотид) в качестве пуринов и пиримидинов, которые микоплазмы синтезировать не могут, а получают в готовом виде из этих соединений с помощью ферментов.

2. Питательные среды должны обеспечивать микоплазмы источниками энергии. Они имеются в экстрактах, полученных при отваривании сердечной мышцы, печени и др. органов, и вносятся в среду дополнительно в виде глюкозы (для видов, ферментирующих глюкозу), аргинина (для видов, ферментирующих аргинин) и мочевины (для уреаплазм). При разложении этих компонентов изменяется рН среды, поэтому среда должна быть забуферена.

При выделении микоплазм из клинического материала необходимо посеять анализируемые пробы (0,1 мл) в транспортную среду (1 мл) - среду той же прописи, что и для культивирования, но без источников энергии (глюкозы, аргинина и мочевины) и с большим количеством антибиотиков для подавления сопутствующей флоры: пенициллина (1000 ед./мл) и любого антибиотика, подавляющего рост грибов. Посевы выдерживают 30 мин. при комнатной температуре, затем переносят в среду культивирования (0,1 мл на 1 мл среды) и помещают в термостат (37 С) на 3 дня (для выделения U. ш-ealyticum), 7 дней (для М. hominis) и 3 недели (для М. pneumoniae, М. genitalium). О росте в бульоне судят по изменению цвета среды: U. urealyticum и М. hominis изменяют цвет среды из красного в красно-фиолетовый, при этом в случае U. urealyticum среда остается прозрачной, а М. hominis дает легкую опалесценцию. М. pneumoniae, M. genitalium изменяют цвет среды из красного в желтый. Для того чтобы убедиться, что изменение цвета среды связано с ростом микоплазм (уреаплазм) необходимо сделать высев из бульона на агар, приготовленный на той же основе и спустя указанные выше отрезки времени просматривать чашки при малом увеличении микроскопа. Для выделения М. hominis, М. pneumoniae и М. genitalium можно делать высев из транспортной среды непосредственно на чашки, минуя бульон.

Достоинством культуральных методов является их 100% специфичность и возможность получения чистой культуры для дальнейшего исследования выделенных штаммов, в частности испытания их чувствительности к антибиотикам. Недостатками культуральных методов являются их низкая чувствительность, связанная с неадекватностью питательных сред, неспособность некоторых штаммов микоплазм расти в отсутствии живых клеток и длительность культивирования.

В приложении приводятся прописи сред, наиболее часто используемых для культивирования микоплазм (1) и уреаплазм (2).


Наиболее часто используемые серологические методы . Выявление антигенов.


1. Реакция агрегат - гемагглютинации (РАГА)

РАГА позволяет выявить наличие антигена микоплазм в сыворотке крови больного в концентрации 0,001 - 0,0001 мкг/мл (по белку). Особенность РАГА заключается в том, что для сенсибилизации эритроцитов используют агрегированные глютаровым альдегидом (ГЛА) белки иммунной сыворотки, при этом антитела вводятся в состав трехмерных белковых комплексов, вследствие чего часть активных центров антител отдаляется от поверхности эритроцита и становится более доступной для детерминант антигена.

Постановка РАГА Реакцию ставят в планшетах микротитратора «Такачи» с V-образными лунками. Исследуемые пробы сывороток разводят нормальной сывороткой кролика до 0,2% концентрации. Затем делают несколько последовательных двукратных разведении (с помощью мерных петель или автоматических микропипеток), внося в лунки по 25 мкл, и добавляют в таком же объеме эритроцитарный диагностикум. Планшеты инкубируют в течение 2 ч. при 37°С; полученные результаты учитывают по 4-крестной системе.

Учет результатов.

Контроли обеспечивают: 1) проверку специфичности тест-системы (сенсибилизированные эритроциты + разведения гетерологичных антигенов); 2) проверку чувствительности тест-системы, т.е. определение наибольшего разведения гомологичного антигена, дающего реакцию гемагглютинации с эритроцитами, сенсибилизированными иммунной сывороткой; 3) определение титров при возможной неспецифической реакции с сенсибилизированными эритроцитами. Для этого эритроциты, сенсибилизированные агрегированной нормальной кроличьей сывороткой, вносят в исследуемые пробы (в разных разведениях). Титр при неспецифическом взаимодействии обычно не превышает 1:4.

Минимальный диагностический титр 1:8.


1. Иммуноферментный анализ (ИФА) Чувствительность реакции - 0,001 - 0,0001 мкг/мл (по белку)

Постановка реакции. В лунки полистироловых планшетов вносят 100 мкл специфических иммуноглобулинов, выделенных из антимикоплазменной сыворотки кролика в концентрации 10 мкг/мл (по белку) в КББ; рН 9,6. Планшеты инкубируют в течение 18 ч при +4°С, после чего лунки трижды отмывают (по 5 мин) ФСБ с 0,05% раствором твина-20 и удаляют остатки буфера. В лунки вносят приготовленные на ФСБ с твином разведения исследуемых сывороток в объеме 100 мкл. После инкубации в течение 1 ч при 37°С трижды отмывают ФСБ с раствором твина-20. Затем в лунки вносят 100 мкл конъюгата, представляющего собой специфические иммуноглобулины, меченные перксидазой хрена. Конъюгат разводят ФСБ с раствором твина-20 (рабочее разведение указано на этикетке ампулы). Смесь инкубируют в течение 1 ч при 37°С, лунки трижды отмывают от несвязавшегося конъюгата.

Реакцию «проявляют» путём внесния в лунки планшета 100 мкл свежеприготовленного субстрат-индикаторного раствора, содержащего 0,04% ортофенилендиамина, 0,006% Н^О^ в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере (рН 6,0) и инкубируют в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливают путем добавления 1Н р-ра H2S04.

Учет результатов. Результат взаимодействия фермента с субстратом обнаруживают колориметрически (по оранжевому окрашиванию). При визуальном учете реакция считается положительной, если титр исследуемой сыворотки в 2 раза и более превышает таковой в контроле. При спектрофотометрическом учете результатов показатели ОП анализируемой пробы (при 492 нм) должны в 2 и более раз превышать показатели ОП контрольной пробы. Минимальный диагностический титр - 1:200. Специфичность реакции проверяют с помощью гетерологичных антигенов и торможения реакции избытком специфических антител. Дополнительным контролем является контроль субстрата и неспецифической адсорбции конъюгата.


2. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ)

Данный метод может быть использован для быстрого обнаружения антигенов микоплазм в некоторых биосубстратах: в мазках из носоглотки, мокроте, плевральной жидкости, мазках из уретры, влагалища и др.

Принципы этой реакции, методы забора и подготовки материала такие же, как и при исследовании на хламидиоз. Соскоб или каплю исследуемого материала наносят на чистое и обезжиренное предметное стекло и распределяют тонким слоем. Препарат подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне или этаноле (96°) в течение 15 мин. Фиксированные препараты могут сохраняться в холодильнике при +4 С. Препараты должны содержать большое количество клеток.

Постановка реакции. Препарат делят стеклографом на 2 части для одновременного контролирования специфичности метода. Одну часть обрабатывают специфической гипериммунной кроличьей сывороткой в рабочем разведении. После этого препарат помещают во влажную камеру на 30 мин при 37 °С.

Рабочее разведение предварительно определяют на серии одинаковых препаратов, приготовленных из отмытой бульонной культуры микоплазм или отпечатков колоний. Наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается специфическое свечение клеток микоплазм, принимают за рабочее. Последовательные разведения иммунной сыворотки делают 0.001 - 0,15 М раствором ФСБ; рН 7,2 - 7,4.

Через 30 мин препараты промывают в 3-х порциях ФСБ (рН 7,2 - 7,4), подсушивают на воздухе и обрабатывают всю поверхность антителами, меченными флюорохромом, взятыми из рабочего разведения. Рабочее разведение меченого антивидового глобулина указано на каждой ампуле и обычно соответствует оптимальному. Затем препараты помещают на 30 мин во влажную камеру при 37°С, трижды промывают ФСБ, споласкивают водопроводной водой, подсушивают на воздухе и просматривают под люминесцентным микроскопом в падающем свете с иммерсией.

Учет и оценка результатов. Положительная реакция проявляется в виде интенсивного изумрудно-зеленого гранулярного свечения микоплазм на мембранах клеток и в межклеточном пространстве.

Результат считается положительным, если в препарате обнаруживается не менее 10 светящихся зеленых гранул.

Данный метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, он применим для выявления микоплазм практически в любом материале и позволяет количественно оценить массивность инвазии возбудителя. Метод используют для выявления тех видов микоплазм, к которым имеются специфические гипериммунные сыворотки, но отсутствуют тест-системы для прямой РИФ.


3. Реакция прямой иммунофлюоресценции (РПФ)

Для обнаружения антигенов М, hominis, U. urealyticum, и М. pneumoniae в настоящее время выпускаются препараты отечественного производства («МикогомоФлюоСкрин», «УреагениФлюоСкрин» и «МикопневмоФлюоСкрин», ЗАО «Ниармедик-Плюс» на базе НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

В качестве флюоресцентной метки используют ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), микоплазмы и уреаплазмы окрашиваются в ярко-зеленый цвет, выявляются на мембране клеток и в межклеточном пространстве. Техника постановки реакции изложена в инструкциях к препаратам. Метод требует минимальной затраты времени (=:1.5 ч).


Выявление антител к микоплазмам.

Антитела к микоплазмам выявляют с помощью различных реакций; ингибиции роста (РИР), ингибиции метаболизма (РИМ), микоплазмацидного теста, РСК и др. В последние годы наиболее часто применяют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) и иммуноферментный анализ (ИФА). Материалом для исследования служит сыворотка крови.

Часто приходится исследовать парные сыворотки, т.к. диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике заболевания в 4 и более раз. При урогенитальном микоплазмозе выявление антител имеет меньшую диагностическую ценность, чем выявление антигенов, т.к. инфекция, как правило, имеет хроническое течение, а «урогенитальные» микоплазмы являются слабыми антигенными раздражителями. Тем не менее и при урогенитальных микоплазмозах в ряде случаев необходимо проводить исследование на наличие антител.


1. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Чувствительность реакции 0,01 - 0,001 мкг/мл (по белку).

Постановка реакции. Постановку реакции осуществляют в планшетах микротитратора «Такачи», исследуемые сыворотки разводят в 0,2% р-ре нормальной сыворотки кролика. Для двукратного разведения сыворотки больных используют петли или микропипетки на 25 мкл. В таком же объеме вносят в лунки тест-эритроциты. После инкубации в течение 2 ч при 37°С проводят учет полученных результатов по 4-крестной системе.

Учет результатов (++++) - агглютинат выстилает дно всей лунки; (+++) -агглютинат выстилает 50% всей поверхности лунки; (++) - агглютинат выстилает 25% поверхности лунки; (+) - агглютинат выстилает небольшой ореол вокруг осадка; (-) -агглютинат образует компактный осадок на дне лунки.

Положительными считаются реакции с четкими показателями: (++++), (+++) и (++). Диагностический титр - 1:32.

Контроли обеспечивают: 1) проверку специфичности тест-системы (сенсибилизированные эритроциты + разведения гетерологичных антител); 2) проверку чувствительности тест-системы, т.е. определение наибольшего разведения гомологичных антител (антисыворотки).

При микоплазмозе диагностическое значение придают увеличению титров специфических антител в парных сыворотках крови (в 4 раза и более) в динамике заболевания. Первую пробу сыворотки крови получают у пациента в начале заболевания (желательно в первые 7 дней), вторую - через 10-14 дней от начала заболевания.

2. Иммуноферментный анализ (ИФА)

Чувствительность реакции 0,001 - 0,0001 мкг/мл (по белку).

Постановка реакции. В лунки полистиролового планшета вносят по 100 мкл растворимого антигена микоплазм (концентрация 10 мкг/мл) в (КББ); рН 9,4. Антигены представляют собой белковую фракцию, выделенную из цитоплазматической фракции клеток микоплазм при введении (NH4)2S04. Планшеты инкубируют при 4°С в течение 18 ч, затем трижды отмывают по 5 мин ФСБ с 0,05% раствором твина-20 и тщательно удаляют остатки буфера. В лунки, сенсибилизированные антигеном, вносят последовательно двукратно разведенные исследуемые сыворотки в объеме 100 мкл либо титруют автоматической микропипеткой в ФСБ с раствором твина-20. Начальное разведение сывороток 1.100. После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшеты трижды отмывают ФСБ с 0,05% раствором Твина-20.

В лунки вносят конъюгат, содержащий меченые пероксидазой хрена антитела (кролика) к глобулинам сыворотки человека в рабочем разведении в объеме 100 мкл. Для разведения используют ФСБ с твином. После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшеты трижды отмывают от избытка конъюгата и вносят 100 мкл свежеприготовленного субстрат-индикаторного раствора, содержащего 0,04% раствор ортофенилендиамина, 0,05% Н2О2 в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере и инкубируют в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливают путем добавления 1H p-pa H2S04.

Учет результатов. Интенсивность окрашивания в лунках определяют спектрофотометрически (при длине волны 492 нм) или визуально. При визуальном учете реакция считается положительной, если титр исследуемой сыворотки в 2 раза и более превышает таковой в контроле. При спектрофотометрическом учете результатов показатели оптической плотности (ОП) анализируемой пробы должны в 2 и более раз превышать показатели ОП контрольной пробы. ЗАО «Ниармедик-плюс» при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН выпускает препараты для выявления антител к М. hominis ("МикоплазмоСкрин"), U. urealyticum ("УреагениСкрин") и М. pneumoniae ("МикопневмоСкрин") с соответствующими инструкциями по их применению.


Молекулярно-биологические методы.

Полимеразная цепная реакция ПЦР)

Для реакции амплификации берут 25 - 50 мкл среды. Смесь, используемая для реакции, содержит: 60 ммоль. трис-НСl (рН 8,8), 16,6 ммоль. (NH4)24, 1,5 ммоль MgCl2, 10 ммоль каждого из четырех дезоксирибонуклеотид-трифосфатов, по 12 нмоль каждого праймера, ДНК-мишень (до 1 мкл) и 2 ед. Taq-полимеразы.Для проведения ПЦР используют амплификатор. Программа амплификации включает 30 - 35 циклов в режиме: денатурация - при 94 С в течение 1 мин, отжиг праймеров - при температуре от 45 до 65 °С (величина рассчитывается теоретически, что соответствует температуре плавления используемых праймеров) - в течение 0,5 мин, синтез - при 72 °С в течение 2 мин. Продукты амплификации после электрофореза выявляют в 1,2% агарозном геле, окрашенном этидиум-бромидом. Наличие фрагмента ДНК с заданным показателем учитывается в качестве положительного результата.

Ампликон выявляют также путем гибридизации продукта амплификации с биотилированным или меченым радиоактивным изотопом олигонуклеотидом, комплементарным последовательности ДНК, расположенной внутри амплифицируемого фрагмента. Гибридизацию проводят на фильтрах или в микропланшетах. Последнее дает возможность количественно оценивать результаты ПЦР.


Сравнение чувствительности методов.

В табл. 8 представлены сравнительные данные по чувствительности трех методов (микробиологического, РАГА и РИФ) выявления микоплазм у больных с хроническими воспалительными заболеваниями УГТ, обратившихся для исследования и лечения в Диагностические центры при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Из данных таблицы следует, что РИФ и РАГА обладают приблизительно одинаковой чувствительностью, более высокой, чем микробиологический метод.

В табл. 9 представлены результаты сравнения четырех методов (микробиологического, РАГА, ПЦР и AT в РПГА). Из данных таблицы следует, что РАГА и ПЦР близки по чувствительности, вместе с тем, в РАГА удавалось выявлять АГ микоплазм несколько чаще, чем ДНК (живые клетки). AT к микоплазмам в РПГА выявляли лишь приблизительно у 25% инфицированных лиц, что может быть связано с низкой чувствительностью метода -d также с низкой иммуногенностью возбудителя и иммуносупрессивным состоянием, развитию которого способствует наличие микоплазменной инфекции.

Следует заметить, что в каждой группе обследованных лиц были такие, у которых микоплазмы и уреаплазмы обнаруживали лишь одним из примененных методов. Следовательно, расширение обследования с использованием нескольких методов дает более точные представления об инфицированности пациента.

По нашим наблюдениям, для диагностики респираторного микоплазмоза наиболее информативными являются РАГА, РИФ и ПЦР (выявление возбудителя) и исследование парных сывороток в РПГА либо ИФА. Четырехкратный подъем титра AT в динамике свидетельствует о наличии инфекции. Для диагностики урогенитального микоплазмоза наиболее информативными являются РАГА, РИФ и ПЦР.


Таблица 8. Выявление М. hominis и U. urealyticum тремя методами (РАГА, РИФ и микробиологическим)


Кол-во обследованных б-х

Выявлены

M. hominis

U. urealyticum

в РАГА

в РИФ

микробиол. методом

в РАГА

в РИФ

микробиол. методом

881

325

305

105

387

388

278



Таблица 9. Сравнение результатов выявления М. hominis и U. urealyticum в ПНР, РАГА и микробиологическим методом и антител к ним в РПГА


Кол-во обследованных б-х

Выявлены

M. hominis

U. urealyticum

РАГА

ПЦР

микробиол. методом

РПГА

РАГА

ПЦР

микробиол. методом

РПГА

50

34

30

17

7

41

38

18

10


Трактовка результатов. При совпадении результатов микробиологического метода и РАГА, РИФ и ПЦР или только РАГА, РИФ и ПЦР или РАГА и РИФ или РАГА и микробиологического метода можно говорить о наличии генерализованной инфекции, либо очага, откуда микоплазмы поступают в кровь.


При несовпадении результатов указанных методов возможны следующие варианты и их объяснения:


РАГА +, РИФ-, микробиол. -

РАГА - , РИФ + либо РАГА -, микробиол. +

РАГА + , ПЦР + , микробиол - либо РАГА + , РИФ + . микробиол -

РАГА -, РИФ -, ПЦР +

Плохо взят материал для исследования (на стекле мало клеток)

Материал взят хорошо (на стекле много клеток), имеет место антигенемия

Имеется местный очаг инфекции, процесс не генерализован

Культуральная среда не соответствует требованиям, либо микоплазмы «некультивируемые»

Малая множественность инфекции, возможно здоровое носительство

Анализ нужно повторить

Анализ нужно повторить через 1 месяц






Достоинства и недостатки диагностических методов. В таблице 10 перечислены достоинства и недостатки различных диагностических методов.


Метод

Достоинства

Недостатки

Микробиологи­ческий метод

Возможность получения чистой культуры и последующего изучения выделенных штаммов, в частности, их чувствительности к антибиотикам

1. Низкая чувствительность

2. Длительность исследования (для М. hominis - 7 дней, для M.pneumoniae - 3 недели).

РАГА

1. Экспресс-метод

2. Высокая чувствительность

1. Отсутствие стабильного диагностикума

2. Необходимость работать с живой культурой возбудителя для получения биомассы и иммунизации животных

РИФ

1. Экспресс-метод

2. Высокая чувствительность

3. Наличие диагностических тест-систем

1. Некоторый субъективизм в оценке результатов

2.Зависимость результатов исследования от качества забора

материала

ПЦР

Высокая чувствительность

1. Необходимость иметь специальное оборудование

2. Зависимость результатов от качества забора материала и используемых реагентов

ИФА (выявление антител)

1. Экспресс-метод

2. Высокая чувствительность

3. Наличие отечественных тест-систем

Возможна неспецифичность результатов за счет перекрестных реакций с нормальными антителами

РПГА

Экспресс-метод

1. Низкая чувствительность

2. Отсутствие стабильного диагностикума

3. Необходимость работать с живой культурой возбудителя для получения биомассы и иммунизации животных


ПРИЛОЖЕНИЕ

I. Среды для культивирования микоплазм

1.1. Модифицированная среда Хайфлика. Среда пригодна для культивирования большинства видов микоплазм.

Настой говяжьего сердца (Difco) - 2,85 г, дистиллированная вода - 90 мл. Стерилизовать автоклавированием (121°С, 20 мин, 1,5 атм.). Добавить сыворотку крови лошади - 20 мл, свежий 25% экстракт дрожжей - 10 мл, ДНК (Sigma) - 1,2 мл, таллия ацетат (1% раствор) - 1 мл, пенициллин; рН 7,7. Для приготовления агаризованной среды добавить перед автоклавированием 1,4 г очищенного агара (L28, Oxoid) либо 0,6 - 0,8% агара Нобеля (Difco).

1.2.Среда5Р-4

Среда пригодна для выделения и культивирования плохо растущих видов микоплазм человека (М, pneumoniae, M. genitalium, M. fermentans шт. incognitus)

Микоплазменный бульон (Bacto PPLO broth, Baltimor Biological Laboratiries) - 1 г, бактопептон (Difco) - 1.6 г, бактотриптон (Difco) - 3 г, деионизированная вода - 197 мл; довести рН до 7,8 (берут 0,6 мл 2Н раствора NaOH). Стерилизовать автоклавированием (121°С, 30 мин, 1,5 атм.). Добавить: индикатор - 0,5% раствор фенолового красного - 1,2 мл, пенициллин из расчета 100 000 ЕД/мл - 3 мл, 2% раствор препарата дрожжей (Yestolate), пропущенный через фильтр с порами 450 и 220 нм, - 30 мл, среду для культивирования клеток позвоночных CMRL - 1066 (х10) с глутамином, но без NaHCО3 (Gibco) - 15 мл, 25% свежий дрожжевой экстракт (Flow Laboratories) - 10.5 мл, сыворотку эмбриона коровы, прогретую в течение 1 ч при 56 °С - 50 мл, 50% раствор глюкозы - 3 мл; рН 7,4. Готовую среду пропустить через фильтр с порами 220 нм.

1.3.Среда, разработанная Г.Я. Каган и используемая в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва). Триптический гидролизат мышцы говяжьего сердца - 200 мл, мясная вода - 400 мл, 25% дрожжевой экстракт - 100 мл, NaCI 0,5%, вода водопроводная - 300 мл. Добавить сыворотку крови лошади - 20 мл, 40% раствор аргинина - 2%, 40% раствор глюкозы - 1%, пенициллин из расчета 100 ЕД/мл (конечная концентрация), таллия ацетат 1:2000 (конечная концентрация). Для трудно культивируемых штаммов рекомендуется добавлять : 25% раствор пептона - 2%, комплекс витаминов для среды Игла - 0,002%, ДПН, либо НАД - 0,002%. НАД, ДПН, таллия ацетат и аргинин разводят в дистиллированной воде, стерилизуют фильтрованием через фильтр с порами 220 нм. РН 7,8. Для приготовления агаризованной среды добавить перед автоклавированием агар - 0,3% (полужидкая среда) или 1,3% (полутвердая среда),

Гидролизат сердечной мышцы готовить следующим образом: к 1 части измельченного мяса добавить 1,5 части воды, кипятить 10 мин, полусваренную массу пропустить через мясорубку; рН отвара довести до 7,8 - 8,0. К 10 л отвара добавить б кг фарша, 1,5 кг поджелудочной железы и 300 мл хлороформа. Ферментация - 10 дней при 46 °С, затем фильтровать; рН 7,0.

1.4. Среда на основе гидролизата Р-глобулиновой фракции, полученной из отходов гамма-глобулинового производства.

Гидролизат Р-глобулиновой фракции получают путем добавления к Р-глобулинам 10% гомогенной массы поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиньи и 1% хлороформа. Ферментация при рН 7,8 - 7,9 72 ч. при 37 °С с периодическим встряхиванием. Полученный гидролизат фильтруют, консервируют хлороформом и хранят при 4 °С до употребления. Этот препарат используют в качестве основы для жидкой и полутвердой питательных сред. При этом его разводят водопроводной водой до следующих стандартов: общий азот - 380 - 450 мг%, аминный азот - 280 -300 мг%. К основе добавляют: 25% дрожжевой экстракт - 10%, глюкозу - 0,5%, глицерин - 0,5%, NaCI - до 0,5%. РН 7,8 - 8,0. Стерилизовать автоклавированием (121 °С, 20 мин, 0,6 атм.). Добавить сыворотку крови лошади или человека - 20%, холестерин - 0,05 - 0,1%, пенициллин - 500 ЕД/мл.

2. Среды, используемые для выделения и культивирования уреаплазм.

2.1. Бульон, содержащий мочевину и индикатор (Urease color test broth U 9C)

Триптиказосоевый бульон BBL №11768 - 1,5 г или триптический перевар ВВ № 11754 - 1,5 г, MgCl2 x 6H20 = 0,02 г, дрожжевой экстракт (Difco № 0127) - 0,1 г, деионизированная вода - 90 мл, довести рН до 5,5 (берут 2Н раствор НСl) , стерилизовать автоклавированием (121 °С, 15 мин, 1,5 атм.). Добавить: сыворотку крови лошади (неинактивированную) - 10 мл, мочевину (10% р-р)- 0,3 мл, L-цистеин - НС1 (2% р-р) - 0,5 мл, GHL- трипептид (глицил-L-гистидил-L-уксусный лизин (Calbiochem Behring) раствор из расчета 20 мг/мл - 0,1 мл, феноловый красный (1% автоклавированный р-р) - 0,1 мл, пенициллин из расчета 100 000 ЕД/мл. - 0,1 мл. Мочевину, L-цистеин - НСl и раствор трипептида стерилизовать фильтрованием через фильтр с порами 220 нм. Хранить при -20 °С.

Изменение цвета среды от желтого до розового или красного при сохранении прозрачности бульона свидетельствует о росте U. urealyticum и наличии уреазной активности,

2.2. Бульон, содержащий мочевину и индикатор - среда 10С

Бульон PPLO (PPLO broth W/o CV, Difco) - 1,47 г, деионизированная вода - 70 мл;

довести рН до 5,5 (берут 2Н раствор НС1) и стерилизовать автоклавированием (1210С, 15 мин, 1,5 атм). Добавить: сыворотку крови лошади (неинактивированную) - 20 мл, 25% водный экстракт сухих дрожжей - 10 мл,, L-цистеин - НСl (2% р-р) - 0,5 мл, мочевину (10% р-р)- 0,4 мл, раствор, содержащий стимуляторы роста, витамины и аминокислоты (CVA, Cat. № D-1000, D-1500), раствор трипептида GHL (из расчета 20 мг/мл) - 0,1 мл, феноловый красный (1% автоклавированный р-р) - 0,1 мл, пенициллин из расчета 100 000 ЕД/мл. - 0,1 мл. Мочевину, L-цистеин - НСl и раствор трипептида стерилизовать фильтрованием через фильтр с порами 220 нм. Хранить при -20 С.

Изменение цвета среды от желтого до оранжево-красного при сохранении прозрачности бульона свидетельствует о росте U. urealyticum и наличии уреазной активности.

2.3. Стандартная агаризованная среда А5К

Триптиказосоевый бульон BBL - 2,4 г, деионизированная вода - 80 мл, рН доводят до 5,5 (берут 2Н раствор НС1), агар Gibco. Стерилизовать автоклавированием (1210С, 15 мин, 1,5 атм.). Добавить то же, что и к среде 10С.

2.4 Дифференцировочные агаровые среды А7 и А8.

Эти среды готовят и стерилизуют так же, как среду А5К.

Добавить в качестве индикатора к среде А7 MnS04 х 6Н20 - 0,03% или к среде А8 CaCl2x2H20- 0,014%.

Колонии уреаплазм окрашиваются в темно-коричневый цвет. При этом колонии М hominis не окрашиваются.

2.5. В НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН используют бульон и полутвердый агар, приготовленные на основе триптического первара сердечной мышцы (см. 1.3). Стерилизация автоклавированием (1210С, 30 мин, 1,5 атм.). После автоклавирования добавить: феноловый красный - 0,003%, мочевину - 0,05%, сыворотку крови лошади - 20%, пенициллин - из расчета 1000 ЕД/мл. Для приготовления агаризованной среды добавить 1.3% агара.

2.6. Фирма Bio Merieux (Франция) предлагает для выделения М. hominis и U. urealyticum готовые наборы питательных сред ("Mycoplasma - Lyo").


П. Приготовление диагностикума для РАГА.

Эритроциты крови человека (группа 0(1), резус-отрицательная) тщательно отмывают от сывороточных белков изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендируют до 8% концентрации и добавляют 25% водный раствор ГЛА (фирма "Serva") до его конечной концентрации (0,25%). После инкубации в течение 3 ч при 37 °С эритроциты отмывают 4 раза ресуспендируют в нем, добавляют ГЛА до его конечной концентрации (0,25%). Гипериммунную сыворотку кролика (специфические антитела) в количестве 1 мл смешивают с 80 мкл 2,5% раствора ГЛА в изотоническом растворе хлорида натрия) и инкубируют в течение 1 ч при 37°С, затем соединяют с осадком эритроцитов, отмытым изотоническим раствором хлорида натрия и полученным из 1 мл 8% стабилизированной взвеси. В эту смесь вводят МаНСОз (до конечной концентрации 2%) и инкубируют при 56 °С 1 час 30 мин в условиях водяной бани. Сенсибилизированные таким образом эритроциты трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия и ресуспендируют в 10 мл этого раствора. Для консервации вносят мертиолят (конечная концентрация 1:10 000) и хранят при +4 °С. Полученный эритроцитарный диагностикум (тест-эритроциты) сохраняет свою активность в течение 1 мес.


III Приготовление диагностикума для РПГА. Для постановки реакции используют стабилизированные и активированные глютаровым альдегидом эритроциты человека, имеющего 0(1) группу крови, резус-отрицательную, сенсибилизированные растворимым антигеном микоплазм. Антиген представляет собой центрифугат ультразвукового дезинтеграта биомассы микоплазм (2х108 КОЕ/мл); для сенсибилизации используют раствор антигена в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащий белок (2 мг/мл).

8% взвесь стабилизированных эритроцитов (1 мл) отмыть трижды, суспендировать в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия и внести 10 мл раствор танниновой кислоты в разведении 1:50 000. После инкубации в течение 30 мин при 37 °С отмыть их 3 раза, ресуспендировать в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия и внести равный объем предварительно оттитрованной дозы антигена (в разведении 1:40 - 1:160). Инкубировать в течение 30 мин при 370С и после однократного промывания в изотоническом растворе хлорида натрия в десятикратном объеме ресуспендировать в 10 мл этого же раствора, внести в качестве консерванта мертиолят (конечная концентрация 1:10 000). Хранить при +40С,


Литература

1. Васильева Е.В. и др. Оценка этиологической роли микоплазм, уреаплазм и хламидий в развитии воспалительных заболеваний урогенитального тракта. // Опыт диагностики и лечения больных /ЦКБ МПС России,- М. 1997, стр. 125 - 127.

2 Герасимова Н.М. и др. Применение кларитромицина (клацида) в терапии больных с урогенитальным хламидиозом и уреаплазмозом.// Акт. Вопр. Инфекций, передаваемых половым путем, у детей, подростков и беременных. Уральск. НИИ Дерматовенерологии МЗ РФ, 1999, стр. 185-186.

3. Игнатова И.Г. и др. Опыт применения циклоферона в лечении урогенитальных микоплазмозов. // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматовенерологии», Кемерово, 1998, стр. 18-19.

4. Кузнецов В.П. и др. Инфекционные агенты в этиологии хронических сальпингоофоритов в разработке комплексной терапии с лейкинфероном.// Вестник дерматологии и венерологии, 1994, №4 стр. 22 - 25.

5. Покровский В.И. и др. Этиология, диагностика и этиотропная терапия острых пневмоний. М. «Медицина». 1995 стр. 226 -265.

6. Прозоровский С.В. и др. // Медицинская микоплазмология», М., «Медицина», 1995.-225 с.

7. Раковская И.В., Вульфович Ю.В. // «Микоплазменные инфекции урогенитального тракта», Ассоциация САНАМ, М., 1995.- 66 с.

8. Соловьев С.В. и др. Выявление тетрациклин- и эритромициноустойчивых штаммов урогенитальных микоплазм с помощью ПЦР. ЖМЭИ, 1998. №6, стр. 3-7.

9. Цинзерлинг А.В., Вуду Г.А. «Внутриутробный микоплазмоз».- Кишинев. (Штиинца».- 1986.- 189с.

10. Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: Sophisticated, Reemerging and Burdened by their Notoriety // Emerging Infect. Dis. 1997, vol.3., №1, p.21 - 32

11. Methods of Mycoplasmology. Ed. T.G. Tully, Sh. Rasin. Academic Press.- 1983.- p. 439.
1   2   3   4

Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Микоплазмы и микоплазмозы человека iconМикромир человека — микробы в организме человека

Микоплазмы и микоплазмозы человека iconА. В. Краев возможно ли прожить
С возрастом у человека появляется много болезней – гипертония, атеросклероз, рак и другие страдания. С момента рождения давление...

Микоплазмы и микоплазмозы человека icon„Болезни легких”
Бронхит заболевание органов дыхания человека и животных с поражением стенки бронхов. У человека различают бронхит острый и хронический....

Микоплазмы и микоплазмозы человека iconСегодня трудно найти человека, который не слышал бы этих слов. Оказывается, не менее трудно найти человека, который до конца понимает, что же это собственно, т

Микоплазмы и микоплазмозы человека iconСреди заболеваний человека нередко встречаются паразитарные болезни, которые вызваны гельминтами (червями-паразитами). Эти заболевания получили название гельмин
К наиболее социально значимым и широко распространенным болезням человека, возбудители которых передаются через щучью икру, рыбу...

Микоплазмы и микоплазмозы человека iconКраткий экскурс в историю изучения детерминации активности человека и животных
Демокрит, например, рассматривал нужду (потребность) как основную движущую силу, которая не только привела в действие эмоциональные...

Микоплазмы и микоплазмозы человека iconВич (вирус иммунодефицита человека) — возбудитель вич-инфекции. Открытие вируса произошло в 1983 году. С июля 1986 года для обозначения возбудителя повсеместно принято название «вирус иммунодефицита человека» или «вич». История эпидемии вич-инфекции

Микоплазмы и микоплазмозы человека iconД. И. Ивановский открыл вирусы новую форму существования жизни. Своими исследованиями он заложил основы ряда научных направлений вирусологии: изучение природы вируса, цитопаталогических вирусных инфекций, фильтрующи
Заболевания растений, животных и человека, вирусная природа которых в настоящее время установлена, в течение многих столетий наносили...

Микоплазмы и микоплазмозы человека icon1. Функциональные возможности человека

Микоплазмы и микоплазмозы человека iconАвтопилот у человека привычка

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU