Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология





Скачать 316.33 Kb.
НазваниеКультуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
ДАНКО ЛЕОНИД ЮРЬЕВИЧ
Дата конвертации24.05.2013
Размер316.33 Kb.
ТипАвтореферат
На правах рукописи


ДАНКО ЛЕОНИД ЮРЬЕВИЧ


КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА


МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ


06.02.02 – ветеринарная микробиология,

вирусология, эпизоотология, микология с

микотоксикологией и иммунология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

ветеринарных наук


Санкт-Петербург-2011

Работа выполнена в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц

Государственного научного учреждения Всероссийский научно – исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии)


НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор ветеринарных наук

Трефилов Борис Борисович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор ветеринарных наук, профессор

Придыбайло Николай Дмитриевич

доктор биологических наук, профессор

Ярыгина Елена Игоревна


ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет»


Защита диссертации состоится «11» мая 2011 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».


Автореферат разослан « » 2011 г. и размещен на сайте http://spbgavm.ru


Ученый секретарь

диссертационного совета Белова Лариса Михайловна


Введение


Актуальность темы. Метапневмовирусная инфекция широко распространена в стадах коммерческой птицы (куры-несушки, бройлеры и индейки) в птицеводческих хозяйствах разных стран мира (S.B. Buys & J.H. Du Preez, 1980; S.B. Buys et al., 1986; J.S. Mc Dongall & Cook, 1986; G.P. Wilding et al., 1986; A.N. Alkhalaf, 2002; R.C. Jones, 2004).

Первичная вирусная инфекция часто осложняется болезнями бактериальной и вирусной природы, ведущими в результате к высокой заболеваемости и смертности (И.А.Борисова, А.В.Борисов, 2009; J.K.A. Cook, 2000).

Случаи возникновения метапневмовирусной инфекции птиц отмечены в птицехозяйствах Российской Федерации (В.Н.Ирза с соавт., 2003,2005; З.Б.Хлебовец с соавт., 2005; Д.В.Дмитриев, 2007; Б.Б.Трефилов с соавт., 2010). У невакцинированных кур-несушек и бройлеров регистрировали специфические антитела к метапневмовирусу.

Исходя из обширных различий в антигенной структуре и аминокислотной последовательности гена, существующие штаммы метапневмовируса классифицированы на четыре подтипа A,B,C,D (И.А.Борисова, 2008; J.K.A. Cook, D. Cavanagh, 2002; M.I. Sabara, J.E. Larence, 2002).

Проблема антигенной структуры метапневмовируса помимо большого теоретического значения представляет в настоящее время существенный практический интерес в период массовой вакцинации против этой болезни, а также при изучении репликации вакцинных и эпизоотических штаммов вируса в организме и культурах клеток и их распространения среди птицы.

Чувствительность клеточных культур к метапневмовирусу птиц установлена многими исследованиями (И.А. Борисова, 2008; А.С.Пронин с соавт., 2006; B. Panigrahy et al., 2000; F.E. Jirjis et al., 2000, J.K.A. Cook et al., 2001). Однако какая бы система не была использована для обнаружения вируса, его идентификация может быть подтверждена при помощи различных серологических методов исследований.

Изучение антигенной специфичности и степени нейтрализации штаммспецифической антисывороткой метапневмовируса птиц в литературе не сообщалось.

Вместе с тем, по результатам исследований сотрудниками ГНУ ВНИИЗЖ (А.С.Пронин с соавт., 2006) установлена циркуляция метапневмовируса птиц на территории РФ подтипов А и В.

В связи с вышеизложенным изучение репродукции метапневмовируса (МПВ) птиц в гомологичных и гетерологичных культурах клеток и определение антигенных штаммовых различий вируса являются актуальными.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение культуральных и антигенных свойств метапневмовируса птиц.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

- выделить метапневмовирус птиц и провести его идентификацию;

- изучить культуральные свойства метапневмовируса птиц;

- изучить антигенные свойства метапневмовируса птиц;

- разработать методические положения по диагностике метапневмовирусной инфекции птиц.

Научная новизна. Установлена возможность использования культуры клеток куриных эмбрионов и клеток Vero для выделения из патологического материала метапневмовируса птиц. Показана возможность культивирования МПВ птиц в различных клеточных культурах и установлена их отличие в чувствительности к вакцинным и эпизоотическим штаммам возбудителя болезни. Выявлена высокая репликационная способность вакцинных штаммов МПВ птиц в клетках Vero.

Впервые изучены антигенная специфичность и степень нейтрализации гомологической и гетерологической штаммспецифической сывороткой вакцинных штаммов МПВ птиц в реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе и установлено их отличие по Ag и An признакам. Определена степень антигенного родства вакцинных и эпизоотических штаммов МПВ птиц.

Практическая значимость работы. Установлена перспективность использования клеток Vero для наработки вирусного материала при изготовлении средств диагностики и специфической профилактики метапневмовирусной инфекции птиц.

Разработаны и утверждены Россельхозакадемией Методические положения «Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц».

Основные положения , выносимые на защиту:

- результаты по выделению изолятов вируса и их идентификации;

- культивирование метапневмовируса птиц в первично-трипсинизированных культурах клеток;

- культивирование метапневмовируса птиц в клетках Vero;

- результаты изучения антигенности вакцинных штаммов метапневмовируса птиц, их антигенной специфичности и степени нейтрализации со штаммспецифическими сыворотками.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2007-2010гг.), на Международном агропромышленном конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и зоотехнии» (Санкт-Петербург, 2009г.); Актуальные проблемы ветеринарии и животноводства: материалы Межрегиональной научно-практической конференции (Самара, 2010).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с ведущим научным сотрудником Никитиной Н. В., за что автор выражает ей сердечную благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре научные статьи.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение.

Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 170 источников, из которых 153 зарубежных.


2.Собственные исследования

2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2007-2010 гг. в отделе вирусологии и опухолевых болезней птиц Государственного научного учреждения Всероссийский научно – исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии) в соответствии с научно-технической программой НИР 08.07.05.

При выполнении работы использовали следующие материалы:

Вирус: вакцинный штамм 8544 подтипа А метапневмовируса птиц (G.P. Wilding, 1986), Nobilis (Голландия); вакцинный штамм VC-03 подтипа В метапневмовируса птиц (Y.P. Picault, 1987), Nemovac Rhone Merieux (Франция); Е-07 эпизоотический штамм метапневмовируса птиц, выделенный в ГНУ ВНИВИП; Н-08 эпизоотический штамм метапневмовируса птиц, выделенный в ГНУ ВНИВИП. Вирусные штаммы поддерживали в перевиваемой линии клеток Vero и хранили при температуре минус 20ºС.

Диагностикумы: набор для обнаружения антител к возбудителю метапневмовирусной инфекции птиц BioCek, производства фирмы “Avian Rhinotracheitis Antibody Test Kit” (Holland); набор для обнаружения антител к вирусу метапневмовирусной инфекции птиц в сыворотках крови кур методом иммуноферментного анализа, производства ГНУ ВНИВИП.

Куриные эмбрионы и цыплята: яйца СПФ кур, фирмы “Lohmann Tierzucht” (Германия), 300 шт.; эмбрионы СПФ кур, фирмы “Lohmann Tierzucht”, 100 шт.; цыплята, инкубированные из яиц СПФ кур фирмы “Lohmann Tierzucht” в ГНУ ВНИВИП, 50 голов.

Культуры клеток: первично-трипсинизированные культуры фибробластов СПФ эмбрионов кур (ФЭК), эмбрионов уток (ФЭУ), эмбрионов гусей (ФЭГ); перевиваемая культура клеток почки зеленой африканской мартышки, клетки Vero (НИИ гриппа АМН, Санкт-Петербург); трахеальная органная культура (ТОК) куриных эмбрионов. Первично-трипсинизированные культуры клеток готовили из кожно-мышечной ткани 10-12 - суточных СПФ куриных, 14-15-суточных утиных и гусиных эмбрионов по методике Dulbecco R.&Vogt M. (1954) в модификации Younger J.S. (1954).

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: питательная среда Игла МЕМ и ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином; питательная среда №199, жидкая, с L-глутамином; питательная среда ДМЕМ/F12 с Hepes, жидкая; сыворотка крови крупного рогатого скота, неконсервированная для культур клеток; сыворотка крови плодов коровы; трипсина раствор, 0,25% фирмы «US BIO»; версена раствор, 0,02%; Хенкса раствор фирмы “Hyclone”. Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы “Hyclone”, производства ООО «Биолот».

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатическому действию (ЦПД) проводили в чувствительной клеточной культуре (ФЭК, клетки Vero) методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench H. (Н.И. Троценко с соавт., 2000) и выражали в lg ТЦД50 в 1,0 см3 (тканевая цитопатогенная доза).

Результаты титрования вируса подвергли статистической обработке методами, изложенными в соответствующих руководствах (Терентьев П.В., Ростова Н.С., 1977).

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководстве по вирусологии (Н.И. Троценко с соавт., 2000).

Титр вируса и конечную точку нейтрализации вычисляли по Reed L.J. & Muench H. на основании ЦПД в культуре клеток через 5-6 суток инкубации после инокуляции культуры. Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали в индексе нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток.

За титр антител принимали то наибольшее разведение сыворотки, которое было способно ингибировать активность вируса, внесенного в указанной дозе, в 50% зараженной культуры.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА). При определении титра (активности) штаммспецифических сывороток и изучении антигенных свойств испытуемых штаммов вируса, а также принадлежности выделенных изолятов вируса, наряду с реакцией нейтрализации, использовали непрямой метод ИФА, разработанный в ГНУ ВНИВИП на подтип А и В метапневмовируса птиц. ИФА ставили согласно инструкции по применению набора и методическим указаниям «Лабораторная диагностика метапневмовирусной инфекции птиц методом иммуноферментного анализа», утвержденным Россельхозакадемией 2009г.

Получение штаммспецифической сыворотки. Гипериммунные сыворотки к изучаемым штаммам метапневмовируса получали на 20-суточных СПФ цыплятах в камеральных условиях (настольных боксах). Вируссодержащий материал (культурная жидкость) в дозе 105 ТЦД50 в см3 вводили подкожно в область нижней третьи шеи двукратно с интервалом 10 сут. После 20-суточного перерыва вирусный антиген, адсорбированный на 0,3% гидроокиси алюминия, инокулировали в объеме 1 см3 подкожно. На 28-30 сут. у цыплят из сердца брали кровь для получения сыворотки, их освобождали от термолабильных неспецифических ингибиторов и хранили во флаконах по 10 см3 при температуре минус 15-20ºС.

Антигенную специфичность (Ag-признак) и степень нейтрализации штаммспецифичной антисыворотки (An-признак) вируса изучали по методу McBride W.D. (1959) в модификации Gard S. (1960). Антигенный характер каждого штамма вируса является специфичным и высокостабильным свойством и не зависит от той чувствительности системы, в которой репродуцируется вирус. Для характеристики Ag-признака по методу McBride применили величину К, которая вычисляется по формуле:

, где

D - рабочее разведение сыворотки;

V0 - исходная активность вируса;

Vt - активность вируса ко времени;

При сравнении Ag-признака штаммов использовали так называемую нормальную величину К (NK). При этом абсолютную величину стандартного штамма, нейтрализованного гомологичной сывороткой, принимали за 100%, а величину NK других изучаемых штаммов выражали в процентах по отношению к величине К стандартного штамма. Степень антигенного родства определяли по формуле Archetti J., Horsfall F.L. (З. Лярски, 1980).

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Выделение метапневмовируса птиц и его идентификация. Для выделения вируса готовили суспензию из выделений носоглотки, слизистой трахеи, синусов головы (тампонов) в растворе Хенкса или физиологическом растворе, содержащем антибиотики в 1 см³: бензилпенициллина 1000 ЕД, 10 мг стрептомицина сульфата, 25 мкг амфотерицина В и выдерживали при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Контроль на стерильность суспензии проводили высевами на МПБ, МПА, среду Китт-Тароцци и агар Сабуро, наблюдение в течение 10 суток. Надосадочную жидкость использовали для инокуляции чувствительной биологической модели.

2.2.1.1. Выделение метапневмовируса птиц на развивающихся куриных эмбрионах.

Для выделения МПВ птиц использовали развивающиеся СПФ куриные эмбрионы 6-7-суточного возраста. Перед заражением эмбрионы овоскопировали и отбирали подвижные с хорошо развитой сосудистой системой. Инфицирование проводили в желточный мешок суспензией патологического материала в объеме 0,1-0,2 см³. Для каждого материала использовали не менее 10 эмбрионов, контролем служили незараженные эмбрионы. Эмбрионы инкубировали в течение 6-7 суток при температуре (37,5±0,5)°С и относительной влажности 55-60% при ежедневном овоскопировании. Погибших в течение 48 часов выбраковывали, а павших в последующие сутки наблюдения и оставшихся живыми после 6-7 суток инкубации охлаждали при 4-6°С и вскрывали. От каждого эмбриона стерильно отбирали экстраэмбриональную жидкость и оболочки желточного мешка. Контроль на стерильность проводили высевами на МПА, МПБ и агар Сабуро. Возможное присутствие вируса устанавливали по наличию следующих изменений в эмбрионе: гибель и гиперемия наружного покрова зародыша в различной степени, замедление развития зародыша, инъекция сосудов и гиперемия желточного мешка. Проводили 2-3 пассажа на куриных эмбрионах. При этом накопление и титры вируса были низкими, поэтому дальнейшую адаптацию вируса проводили на культурах клеток.


2.2.1.2. Выделение вируса на клеточных культурах. Для первичного выделения и последующей адаптации изолята МПВ птиц использовали первично-трипсинизированную культуру клеток, полученную из 10-12-суточных СПФ куриных эмбрионов и перевиваемые клетки Vero.

Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани куриных эмбрионов путем диспергирования в 0,25% растворе трипсина. Культуру выращивали в стационарных условиях в течение 2-3 суток до формирования ровного плотного монослоя в питательной ростовой среде Игла МЕМ и среде № 199 в соотношении 2:1 с содержанием до 10% сыворотки крови КРС и антибиотиков.

Перед заражением пробирочные культуры клеток освобождали от ростовой среды, отмывали поддерживающей средой без сыворотки крови, вносили суспензию из патологического материала (или хориоаллантоисную жидкость зараженных куриных эмбрионов) в объеме 0,2 см³ и оставляли культуру при (37,5±0,5)°C в течение 60 минут для адсорбции вируса. Затем в пробирки с инфицированной культурой вносили 1,0 см³ поддерживающей среды. Зараженные культуры инкубировали в течение 7-9 суток при температуре (37,5±0,5)°C до появления выраженного цитопатогенного действия вируса. Изолят вируса вызывал острую форму вирусной инфекции с характерным цитопатогенным действием: округление клеток и появление в них зернистости на отдельных участках монослоя клеток на 2-3 сутки после инфицирования культуры; дезинтеграция клеток значительной части монослоя и появление разрывов в нем; полная дегенерация монослоя и образование синцитиальных комплексов.

В результате 4-5 последовательных пассажей из патологического материала (носовые выделения, соскобы слизистой оболочки носоглотки, синусов головы и трахеи) на клетках Vero или на развивающихся куриных эмбрионах, с последующей адаптацией на клетках Vero, выделены два изолята вируса Е-07 и Н-08, вызывающие цитопатический эффект в культурах клеток.

2.2.1.3.. Идентификацию изолятов вируса Е-07 и Н-08 проводили в прямой реакции нейтрализации со специфической сывороткой к эталонному вакцинному штамму 8544, а также методом ИФА путем выявления антител в сыворотках крови иммунизированных цыплят этими изолятами (табл. 1).

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что индексы нейтрализации изолятов вируса со штаммспецифическими сыворотками к вакцинным штаммам 8544 и VC-03 метапневмовируса птиц положительные, что свидетельствует о принадлежности изолятов к МПВ птиц. По величинам титров антител в ИФА и индексов нейтрализации можно судить, что выделенные изоляты вируса относятся к подтипу А.

Таблица 1


Изоляты

вируса

Индекс нейтрализации к вакцин-ным штаммам, lgТЦД50, M±m*

Титры антител в ИФА к вакцинным штаммам, M±m**

8544

VC-03

8544

VC-03

Е-07

2,1 ± 0,11*

1,75 ± 0,3

703 ± 15**

501 ± 12

Н-08

2,5 ± 0,2

1,9 ± 0,21

652 ± 12

590 ± 14


Результаты реакции нейтрализации и иммуноферментного анализа


Для подтверждения полученных результатов по идентификации изолятов вируса были проведены серологические исследования на наличие специфических антител к МПВ в сыворотке крови разновозрастной птицы птицехозяйств № 1 и № 2 методом ИФА (табл. 2).

Таблица 2


Птице-хозяй-ство


Изо- ляты виру-са


Титры антител в ИФА, M±m*

Возраст птицы, сут.

1

150

250

360

446

№ 1

Е-07

2643±413*

н.и.

9918±1010

9913±830

н.и.

№ 2

Н-08

н.и.

5699 ± 822

6959 ± 642

9365 ± 948

11259 ± 948


Титры специфических антител к МПВ в сыворотке крови птиц разного возраста (n = 23)

Примечание: н.и. – не исследовали; * - титры в обратных величинах.

При серологическом исследовании выявлены нарастающие титры антител к метапневмовирусу в зависимости от возраста птицы, что свидетельствует о персистенции возбудителя в организме птицы.

2.2.2. Изучение культуральных свойств метапневмовируса птиц

2.2.2.1. Культивирование вируса в первично-трипсинизированных клеточных культурах. Опыты по изучению способности метапневмовируса птиц к репродукции в клеточных культурах проводили в первично-трипсинизированных культурах фибробластов 10-11 – суточных куриных, 14-15 – суточных утиных и гусиных эмбрионов. В качестве питательной ростовой среды применяли среду Игла МЕМ и среду № 199 в соотношении 2:1 с добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков ( бензилпенициллина 100 ЕД/см3 и сульфата стрептомицина 100 мкг/см3). Взвесь клеток вносили в ростовую среду из расчета 700-750 тыс. кл/см3. Культивирование проводили в пробирках по 1,0 см3 под углом 50 и / или во флаконах PS «Orange Scientibic» в стационарных условиях при температуре (37,5 ± 0,5)0 С. Обычно через 24-48 ч инкубирования сформировался сплошной ровный монослой клеток. Специфичность цитопатического эффекта подтверждали реакцией нейтрализации с гомологичными штаммспецифическими сыворотками. При микроскопическом изучении культур клеток, инокулированных вакцинными и эпизоотическими штаммами МПВ, отмечали характерные цитопатические изменения, которые выражались в дегенерации клеток через различные сроки после инфицирования. Так, репликация вакцинных штаммов 8544 и VC-03 в культуре клеток куриных эмбрионов сопровождалась цитопатическим эффектом с первого пассажа и этот феномен обнаруживался через 48-72 часа после инокуляции клеток. В культурах клеток утиных и гусиных эмбрионов вакцинные штаммы адаптировались со 2-3-го пассажа. Штаммы 8544 и VC-03 вируса вызывали развитие острой формы вирусной инфекции в первичных культурах различным латентным периодом в зависимости от вида культуры.

Характер ЦПД выражался в округлении клеток с зернистостью в цитоплазме на ограниченных участках монослоя через 48-72 часа. На 4-5 сутки инкубации зернистость наступала по всему монослою. Полную дегенерацию и гибель клеток куриных эмбрионов отмечали на 6-7 сутки и 8-9 сутки клеток утиных и гусиных эмбрионов после инфицирования с образованием разной величины синцитиальных формаций. Эпизоотические штаммы Е-07 и Н-08 МПВ адаптировались к условиям культивирования в культуре фибробластов куриных эмбрионов с 3-5 пассажа, вызывая цитопатический эффект в виде округления клеток с зернистостью в цитоплазме и формирования небольших синцитий (табл. 3).


Инфекционные титры штаммов МПВ пятого пассажа в первично-трипсинизированных клеточных культурах (P < 0,05)

Таблица 3

Наименование культур клеток

Титры вируса, lg ТЦД50/см3, M±m*

Штаммы вируса:

8544

VC-03

Е-07

Н-08

ФЭК

ФЭУ

ФЭГ

5,25 ± 0,2*

2,75 ± 0,1

2,5 ± 0,2

5,75 ± 0,1

2,75 ± 0,25

2,66 ± 0,1

2,75 ± 0,2

н.и.

н.и.

2,25 ± 0,1

н.и.

н.и.

Примечание: н.и. – не исследовали.

Данные, приведенные в таблице 3, показывали, что в первично-трипсинизированной культуре фибробластов куриных эмбрионов вакцинные штаммы 8544 и VC-03 накапливались в высоких титрах, а способность к репликации эпизоотических штаммов Е-07 и Н-08 в ней была в два раза ниже, что свидетельствует о слабой адаптации штаммов. В культурах фибробластов утиных и гусиных эмбрионах вакцинные штаммы репродуцировали в низких титрах.

В процессе изучения культуральных свойств МПВ птиц вакцинные штаммы 8544 и VC-03 прошли десять пассажей. Результаты представлены в табл.4.

Данные, приведенные в таблице 4, показали, что в культуре ФЭК вакцинные штаммы 8544 и VC-03 накапливались в высоких титрах (5,33± 0,15 и 5,66 ± 0,2 lg ТЦД50/см3 соответственно) и в низких титрах в культурах ФЭУ и ФЭГ (3,4 ± 0,2 и 3,6 ± 0,2 lg ТЦД50/см3).

В результате проведенных исследований установлено, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц имели большую степень репликации в культуре клеток куриных эмбрионов.


Таблица 4

Инфекционные титры вакцинных штаммов МПВ птиц в первично-трипсинизированных культурах клеток (n = 5)


Наименование

культур

клеток


Штамм

вируса


Титр вируса, lg ТЦД50/см3, M±m*

Число пассажей

1

3

5

10

ФЭК

8544

VC-03

5,2 ± 0,1

5,75 ± 0,2

5,33 ± 0,15*

5,66 ± 0,2

5,25 ± 0,2

5,75 ± 0,1

5,15 ± 0,3

5,5 ± 0,2

ФЭУ

8544

VC-03

1,75 ± 0,2

2,5 ± 0,1

2,5 ± 0,15

3,2 ± 0,2

2,75 ± 0,3

3,1 ± 0,3

3,5 ± 0,2

3,6 ± 0,2

ФЭГ

8544

VC-03

1,66 ± 0,2

2,75 ± 0,1

2,1 ± 0,25

2,75 ± 0,1

3,0 ± 0,2

3,7 ± 0,1

3,4 ± 0,2

3,5 ± 0,3



2.2.2.2. Культивирование вируса в перевиваемых клетках Vero. Клетки Vero поддерживали путем пересева с интервалом 5-6 сут безцентрифужным методом. Для снятия монослоя клеток со стекла использовали растворы трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 1:9. Монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса, затем в матрас вносили смесь растворов трипсина и версена, подогретую до 370 С и инкубировали в термостате в течение 5-10 мин до начала отделения клеток от стекла. Раствор версена с трипсином сливали, а клетки ресуспензировали в определенном объеме питательной среды. Клетки подсчитывали в камере Горяева, затем разводили питательной ростовой средой (ДМЕМ/ F12 c Hepes  5-10% фетальной сыворотки и антибиотики) до необходимой концентрации ( 1,5 105 – 2,5  105 клеток/ см3 ). Клетки культивировали в стационарных условиях при температуре ( 37,5 ± 0,5)0 С в пробирках по 1,0 см3 и одноразовых матрасах. В течение 48 ч формировался плотный клеточный монослой, пригодный для инокуляции вирусом. Из сосудов сливали ростовую среду, монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и вносили испытуемый вирус с множественностью заражения 0,1-1,0 lg ТЦД50 на клетку. Инфицированную культуру помещали в термостат для контакта вируса с клетками и выдерживали в течение 30-60 мин при температуре (37,5 ± 0,5)0 С. Затем вносили поддерживающую среду.

Результаты исследований по определению влияния посевной концентрации клеток Vero, их возраста и времени съема вируса на накопление вакцинных штаммов МПВ представлены в табл. 5.


Таблица 5

Влияние посевной концентрации клеток Vero, их возраста и времени съема вируса на его величину инфекционного титра в клетках Vero (n=3)


Время съема вируса,ч

Возраст клеток Vero, ч

Множест-венность заражения, ТЦД50/кл

Концен-

трация клеток, тыс/см3

Титр инфекционности вируса, lg ТЦД50/см3, M±m*

8544

VC-03

24

48-72

0,5

200

3,5 ± 0,1*

3,75±0,2

48

48-72

0,5

200

6,1 ± 0,3

6,5 ± 0,2

72

48-72

0,5

200

6,25± 0,1

6,75 ± 0,1

96

48-72

0,5

200

6,0 ± 0,3

6,5 ± 0,4


Данные, приведенные в таблице 5 , показали, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 имели максимальное накопление 6,25± 0,1 и 6,75 ± 0,1 lg ТЦД50/см3 соответственно в клетках Vero с посевной концентрацией 200 тыс.кл/см3 при оптимальном времени их инокуляции через 48-72 ч и времени съема 72 ч.

Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 вызывали острую форму вирусной инфекции в клетках Vero. Цитопатогенное действие сопровождалось округлением клеток с зернистостью в цитоплазме на ограниченных участках монослоя через 48 ч после инокуляции. На 3-5 сут. инкубации зернистость в клетках наступала по всему монослою. Полную дегенерацию отмечали на 5-7 сут. с образованием больших синцитиальных формаций. Эпизоотические штаммы Е-07 и Н-08 МПВ птиц адаптировались к условиям культивирования в клетках Vero после 2-3 слепых пассажей, вызывая ЦПД в виде округления клеток, появления в них зернистости и формирования небольших синцитий.

2.2.2.3. Культивирование вируса в трахеальной органной культуре. В опытах для получения трахеальной органной культуры использовали СПФ эмбрионы кур, отбор которых проводили за одни сутки до вывода. Подготовку эмбрионов, извлечение зародыша и освобождение трахеи осуществляли по общепринятым методикам. Поперечные срезы колец трахеи незамедлительно переносили во флаконы со средой Игла ДМЕМ, включающей Hepes, 0,2% глюкозу и антибиотики бензилпенициллина натриевой соли 1000 ЕД/см3, сульфата стрептомицина 10 мг/см3. Через 24 часа инкубации при температуре (37,5 ± 0,5) 0С ТОК исследовали под микроскопом на наличие активности ресничек эпителия. Кольца с активностью ресничек на 80-90% инокулировали испытуемыми вакцинными штаммами 8544 и VC-03 МПВ птиц в 1,0 см3 вируссодержащего материала, предварительно удалив из флаконов питательную среду. Флаконы с ТОК оставляли при температуре 37,5 0С на 1 час, снова отмывали и добавляли свежую среду. Культуры контрольные и инфицированные культивировали в течение 5-6 сут при ежедневном исследовании на снижение или отсутствие активности ресничек (цилиостаз). Установлено, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 вызывали незначительное снижение активности ресничек на 3-5% и 7% соответственно. Степень репродукции штаммов МПВ в клетках эпителия трахеи изучали методом титрования в клетках Vero (табл.6). Полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой степени репликации вакцинных штаммов в ТОК и накоплении их в высоких титрах.

Таблица 6

Титры инфекционности вакцинных штаммов МПВ в трахеальной

органной культуре (n = 3)

Штаммы вируса

Титр инфекционности вируса, lg ТЦД50/см3, M±m*

Число пассажей

1

2

3

8544

VC-03

5,1 ± 0,2*

5,4 ± 0,3

5,3 ± 0,33

5,5 ± 0,25

5,33 ± 0,15

5,55 ± 0,15


В процессе изучения культуральных свойств метапневмовируса птиц была определена чувствительность различных клеточных культур к испытуемым штаммам МПВ относительно клеток Vero (табл.7). Результаты показали, что клетки Vero наиболее чувствительны к изучаемым штаммам вируса, а в культуре фибробластов утиных эмбрионов вирус слабо адаптировался.

Таблица 7

Индекс чувствительности клеток Vero, первичных и органной культур вакцинных и эпизоотических штаммов МПВ птиц


Наименование культур клеток

Индекс чувствительности, И

Штаммы вируса:

Вакцинные

Эпизоотические

8544

VC-03

Е-07

Н-08

Клетки Verо


ФЭК


ФЭУ


ФЭГ


ТОК


1,0


0,840


0,076


0,551


0,625


1,0


0,854


0,102


0,542


0,782


1,0


0,760


н.и.


н.и.


0,721


1,0


0,762


н.и.


н.и.


0,706


Таким образом, полученные данные по изучению культуральных свойств МПВ птиц показали, что способность штаммов МПВ к репликации в клеточных культурах была различной.

2.2.3. Изучение антигенных свойств метапневмовируса птиц. Антигенные свойства испытуемых штаммов МПВ птиц изучали на 30-суточных цыплятах путем получения штаммспецифических сывороток. Вируснейтрализующую активность сывороток определяли в реакции нейтрализации в клетках Vero в β - варианте против 1000 ТЦД50 вируса и ИФА. В других опытах реакцию ставили в α - варианте с 4NE сыворотками. Данные, приведенные в таблице 8, показали, что антигенная активность вакцинного штамма VC-03 значительно выше по сравнению со штаммом 8544, что подтверждали значения титров, полученные в α – и β – вариантах реакции нейтрализации и ИФА (2,7 ± 0,16, 6,8 ± 0,43 и 7347 ± 225 соответственно). Активности штаммспецифических сывороток к эпизоотическим штаммам Е-07 и Н-08 как в реакции нейтрализации, так и в ИФА были низкими.


Таблица 8

Антигенная активность штаммов МПВ птиц (n = 5)

Штамм

вируса

Активность сывороток в:

Реакции нейтрализации

ИФА, обратные значения, M±m**

P<

α – варианте, ИН, lg ТЦД50, M±m*

β – варианте,

log2

8544


VC-03


Е-07


Н-08

2,25 ± 0,25*


2,7 ± 0,16


1,77 ± 0,15


1,85 ± 0,2

5,5 ± 0,32


6,8 ± 0,43


н.и.


н.и.

6089 ± 213**


7347 ± 225


703 ± 15


652 ± 12

0,05


0,05


0,05


0,05



Поскольку в настоящее время в РФ контроль над заболеванием основан, главным образом, на вакцинации, нами был поставлен опыт по определению антигенности вакцинных штаммов 8544 и VC-03 на цыплятах 10 - суточного возраста, вакцинированных согласно инструкции по применению живых вакцин, изготовленных из этих штаммов (табл.9).

Таблица 9

Среднегеометрические титры антител в сыворотке крови у вакцинированных цыплят на 21 сут после вакцинации


Сыворотки к вакцинным

штаммам


Титры антител в ИФА* к наборам из:


антигена

8544




Процент выявления



антигена

VC-03


Процент выявления

8544


VC-03


840


834


50


50


777


953




60


87,5




примечание: * - титры антител в обратных величинах.

Данные, приведенные в таблице 9, показали, что вакцинные штаммы индуцировали выработку гуморальных антител в сыворотке крови у привитых цыплят в низких титрах, хотя на штамм VC-03 уровень специфических антител был значительно выше. Необходимо отметить, что при использовании набора для выявления антител к МПВ с антигеном 8544 процент положительно реагирующей птицы составил 50, а титры антител были равными как с гомологичными, так и с гетерологичными антителами. А при использовании набора ИФА с антигеном VC-03 положительно реагирующая птица составила с гомологичными антителами 87,5%, а с гетерологичными антителами была 60%.

Таким образом, вакцинный штамм VC-03, как при вакцинации, так и при гипериммунизации, вызывал синтез специфических антител в более высоких титрах, что свидетельствует о большей антигенности штамма.

2.2.4. Изучение антигенной специфичности вируса ( Ag – признак )

При изучении этиологии случаев заболевания МПВИ птиц в период массовой вакцинации против нее, а также вопросов репликации вакцинных штаммов в организме и их распространения среди птиц, при исследовании генетической устойчивости вакцинных штаммов должны быть получены доказательства происхождения выделенных штаммов от вакцинных или эпизоотических.

Для решения этих вопросов следует: изучить патогенность для цыплят, культуральные свойства и провести идентификацию штаммов при помощи их нейтрализации штаммспецифическими сыворотками. Gard (1960) предложил модификацию теста определения Ag – признака, суть которого заключается в том, что сыворотка иммунизированного животного в состоянии нейтрализовать большее количество гомологичного вируса, чем гомотипичного.

В опытах использовали штаммспецифические сыворотки, полученные путем двукратной иммунизации 30-суточных СПФ цыплят испытуемыми штаммами метапневмовируса птиц. Активность сывороток определяли в реакции нейтрализации в β – варианте в культуре клеток Vero против 500 и 1000 ТЦД50 вируса, а в α – варианте реакцию ставили с 4NE сыворотками. Результаты изучения различий в скорости течения реакции нейтрализации штаммспецифической сывороткой гомологичного и гетерологичного штаммов МПВ птиц кинетическим методом приведены в табл.10. Полученные данные показали, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц нейтрализовались в большей степени за время t = 15 мин контакта при 370 С гомологичной антисывороткой по сравнению с гетерологичной. Так, индекс нейтрализации штамма 8544 штаммспецифической сывороткой равнялся 1,31 – 1,34 lg , а гетерологичной сывороткой – 0,89 – 1,09 lg. Аналогичную картину отмечали в отношении штамма VC-03 МПВ птиц. Значения констант скорости нейтрализации (К) свидетельствовали о достоверности полученных результатов ( > 2).


Таблица 10

Результаты реакции нейтрализации сыворотками к вакцинным штаммам 8544 и

VC-03 МПВ птиц




Штамм

вируса

Сыворотка к штаммам:

8544

VC-03

ИН, lg ТЦД50

Показатель достоверности результатов

К по Мс Bride

ИН, lg ТЦД50

Показатель достоверности результатов

К по Мс Bride

8544

1,34

>2

29,26

1,09

>2

6,72

8544

1,31

>2

13,44

0,89

>2

9,31

VC-03

0,96

>2

3,62

1,83

>2

13,6

VC-03

1,1

>2

8,99

1,57

>2

21,78

Примечание: ИН - индекс нейтрализации;

К - константа нейтрализации.


2.2.5. Изучение степени нейтрализации (An – признак).

Демонстрация подтиповых различий метапневмовируса птиц является наиболее важным недавно сделанным открытием в исследовании возбудителя МПВИ птиц. Поскольку вариации обнаружили в G-протеине, который тесно связан с начальными стадиями болезни, имеется очевидная причастность этого белка к предлагаемой защите при помощи вакцин и серологической диагностики с использованием отдельных подтипов вируса в качестве референтных антигенов в ИФА или в реакциях нейтрализации. Степень нейтрализации испытуемых штаммов штаммспецифической сыворотки (An-маркер) изучали в перекрестной реакции нейтрализации и ИФА. В опытах использовали иммунную сыворотку в постоянной дозе с активностью 4NE (табл.11). Результаты показали, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 нейтрализовались в больших логарифмах в присутствии гомологичной штаммспецифической сыворотки, чем гетерологичной. Однако штамм 8544 оказался менее чувствительным к специфическим антителам штамма VC-03. Степень антигенного родства между штаммами составила от 88 и 90 % в ИФА и реакции нейтрализации соответственно по Archetti a. Horsfall.

Полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемые вакцинные штаммы 8544 и VC-03 отличаются по степени нейтрализации, но в то же время они оказались близкородственными.


Таблица 11

Результаты перекрестных реакций нейтрализации и ИФА вакцинных штаммов специфическими антисыворотками (n=5)



Штамм вируса

Сыворотки к штаммам


P<

8544

VC-03

ИН, lg ТЦД50

ИФА

ИН, lg

ИФА

8544

2,25±0,25


6089±213*


1,82±0,3


4655±341*


0,05

VC-03

1,77±0,2


4868±285


2,7±0,16


7347±225


0,05

Примечание: ИН - индекс нейтрализации;

* - титры антител в обратных величинах.

В результате проведенных исследований выделены от цыплят два изолята вируса и идентифицированы как метапневмовирус птиц со штаммспецифическими сыворотками 8544 и VC-03, принадлежащими к подтипам А и В соответственно. Испытуемые штаммы 8544, VC-03, Е-07 и Н-08 МПВ птиц отличались по культуральным и антигенным свойствам, антигенной специфичности и степени нейтрализации штаммспецифическими сыворотками.

3.Выводы

1. Изоляты вируса, выделенные от цыплят, идентифицированы как метапневмовирус птиц в реакции нейтрализации и ИФА с использованием штаммспецифических сывороток к эталонным вакцинным штаммам 8544 и VC-03, принадлежащих к подтипам А и В метапневмовируса птиц.

2. Перевиваемая линия клеток Vero и культура куриных фибробластов успешно использованы для первичного выделения изолятов метапневмовируса птиц из патологического материала и постановки реакции нейтрализации.

3. Метапневмовирус птиц способен к репликации в различных клеточных культурах эмбрионов птиц и клетках Vero с выраженным цитопатическим эффектом цитолитического типа с образованием синцитий.

4. Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц обладают высокой степенью репликации в клетках Vero и культуре клеток куриных эмбрионов, вызывая острую вирусную инфекцию, обуславливая деструкцию и гибель клеток. В культурах фибробластов гусиных и утиных эмбрионов штаммы вируса индуцируют слабое цитопатогенное действие в клетках и накапливаются в низких титрах.

5. Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц в прививочной дозе индуцируют формирование гуморальных антител в сыворотке крови птиц в низких титрах, в то же время штамм VC-03 отличается большей антигенной активностью.

6. Установлены различия в антигенной специфичности и степени нейтрализации (в скорости течения реакции) вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц. Снижение титра обоих штаммов в процессе нейтрализации для гомологичного по Ag признаку штамма выше, чем для гетерологичного.

7. Вариабельность штаммов МПВ птиц по антигенным свойствам, возможно, обусловлена географической разобщенностью зон их циркуляции.

4. Практические предложения

1. Разработаны и утверждены Россельхозакадемией Методические положения «Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц».

2. Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе со студентами биологических и ветеринарных институтов и на курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов, работающих в области промышленного птицеводства.

5.Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ:


1. Чувствительность клеточных культур к метапневмовирусу птиц / Б.Б.Трефилов,

Л.Ю. Данко// Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. – 2010.-

№1.- С.44-46.


2. Способность метапневмовируса птиц к репродукции в культурах клеток/

Б.Б.Трефилов, Н.В.Никитина, Л.Ю.Данко, В.С.Бочкарев// Ж. Ветеринария и кормление. – 2011. - № 1. – С. 14.


3. Антигенная специфичность и степень нейтрализации вакцинных штаммов метапневмовируса птиц / Трефилов Б.Б., Данко Л.Ю., Бочкарев В.С., Никитина Н.В.// Ж.. Ветеринарная практика. - 2011. - № 1. – С.35-37


Статья, опубликованная в материалах конгресса:

4. Ассоциированное течение респираторных вирусных болезней птиц/ Б.Б.Трефилов, Н.В.Никитина, Л.Ю.Данко, Ф.М.Пунтус// Материалы междунар. агропромыш. конгр. – СПб, 2009. – С. 41-42.

Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconФенотипические свойства и эпизоотологическая значимость e. Coli o157: H7 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconКомплексные мероприятия по профилактике сальмонеллеза птиц в племенных хозяйствах 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconЁ махмадрахимовна распространённость вирусов гриппа птиц в республике таджикистан: иммунологический мониторинг 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconМониторинг инфекционных болезней диких птиц в лесостепной области алтайского края 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconОсобенности эпизоотического процесса и пути совершенствования мер борьбы с гриппом птиц в дагестане 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconСовершенствование иммунопрофилактики гриппа и болезни Ньюкасла у птиц с применением инактивированных вакцин в сочетании с мирамистином 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология icon16. 00. 03 -ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconПрограмма дисциплины од. А 03 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconДиагностика малассезиозов животных 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Культуральные и антигенные свойства метапневмовируса птиц 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология iconЭпизоотология и профилактика дизентерии свиней в южном и северо-кавказском федеральных округах 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU