Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства icon

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства





Скачать 156.75 Kb.
НазваниеУдк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства
Дата конвертации18.06.2013
Размер156.75 Kb.
ТипДокументы
УДК 619:616.98:578.824.11:57.083.223


Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства


Г.Б. Мыктыбаева, Е.С. Жилин, А.Т. Татыбаева, А.Б. Алиева, Е.А. Булатов


РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности»

КН МОН РК, пгт. Гвардейский, Республика Казахстан


e-mail: lau4444@mail.ru, rabies8@mail.ru, ainura_84.08@mail.ru,

alieva_alina_87@mail.ru, erbol_km@mail.ru


В статье представлены результаты опытов по идентификации и выделению изолятов вируса бешенства. С использованием реакции диффузионной преципитации, метода флуоресцирующих антител, иммуноферментного анализа в пробах мозга и слюны установлено наличие антигена вируса бешенства в патологических материалах. Выделение вируса бешенства из патологических материалов проводили путем изоляции на кроликах. В ходе исследований были изучены патогенные и антигенные свойства, а также установлена инфекционная активность выделенных изолятов вируса бешенства.

Ключевые слова: бешенство, идентификация, антиген, тест-система, диагностика, изолят.


Введение


Восприимчивость к заболеванию всех видов домашних и диких животных, огромная опасность для человека определяют социальное и экономическое значение бешенства и привлекают к нему пристальное внимание ветеринарной, медицинской науки и практики.

Несмотря на проводимые мероприятия ограничить распространение рабической болезни, полностью ликвидировать бешенство животных на территории Республики Казахстан до сих пор не удалось, а многие аспекты функционирования паразитарных систем бешенства до сих пор остаются недостаточно изученными.

В большинстве регионов Казахстана эпизоотическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна - резко активизировались природные очаги этой инфекции, увеличилось число случаев заболеваний среди различных видов животных, ежегодно регистрируются случаи заболеваний людей с летальным исходом.

Официальные статистические данные по бешенству животных базируются на пассивном надзоре и не носят системный характер, о чем свидетельствует корреляция объемов проводимых исследований по республике и числа неблагополучных пунктов, что заставляет предположить гораздо большее распространение заболевания в дикой фауне и среди домашних плотоядных.

При отсутствии активной системы надзора в республике, остается не выясненным - какой вид животного является основным резервуаром вируса бешенства, который должен рассматриваться как основной объект профилактических кампаний, как, например, оральная вакцинация против бешенства. Распределение различных вирусных вариантов бешенства и перемещения эпизоотий также остается не выясненным, в конкретном случае из-за отсутствия исследований по выделению и изучению изолятов вируса. Эти ограничения значительно влияют на возможность улучшения контроля и профилактики заболевания в Казахстане.

Вместе с тем в последние годы в большинстве частей мира отмечены инциденты заболевания бешенством вызванные новыми родственными вариантами вируса, индуцирующих фатальные формы энцефалитов, которые квалифицированы как новые генотипы рода Lyssavirus, против которых отсутствует профилактическая вакцинация. Следует отметить, что 2 из 4 новых вариантов лиссавирусов выделены в приграничных с Казахстаном странах Кыргызстане и Таджикистане.

Значимое место в борьбе с бешенством принадлежит ранней диагностике, которая служит основанием для необходимости проведения лечебно-профилактических и противоэпизоотических мероприятий [1]. С этой целью в Казахстане используют лабораторные диагностические тесты: реакция диффузионной преципитации (РДП), метод флуоресцирующих антител (МФА), а также ограниченно используют тесты биопробы на мышах и иммуноферментный анализ (ИФА) [2]. В литературе имеются сообщения об эффективности методов выделения уличного рабического вируса в культуре клеток невриномы Гассерова узла крысы-1 (НГУК-1) для ускоренной диагностики бешенства [3, 4].

Как известно, для возбудителя вируса бешенства характерны различия по степени патогенности, выраженная вариабельность антигенной структуры, для идентификации которых необходимы исследования по выделению и изучению биологических свойств изолятов вируса бешенства.

Научно обоснованные противоэпизоотические и противоэпидемические мероприятия, по данным ряда авторов, должны основываться на изучении особенностей краевой эпизоотологии, прогнозировании ситуации по этому зоонозу, контроле иммунного состоянием животных и людей, вакцинированных против бешенства, а также своевременном выявлении возбудителя бешенства и изучении его биологических свойств.

Целью наших исследований является идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства.


Материалы и методы


В опытах использовали 12 образцов патологического материала (мозг, слюна) от крупного рогатого скота (4), МРС (4), лисиц (3) и корсака (1), полученных из САЯИ ТАСХН Республики Таджикистан и Коллекции микроорганизмов НИИПББ РК.

Для идентификации антигена вируса бешенства использовали диагностикумы: тест-система для лабораторной диагностики бешенства в реакции диффузионной преципитации СТ ДГП 38934366-014-2009 (НИИПББ, РК); тест-система для диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа СТ 405-1919-04 ГП-058–2011 (НИИПББ, РК); тест-система для лабораторной диагностики вируса бешенства методом флуоресцирующих антител СТ ДГП 38934366-016-2009 (НИИПББ, РК); а также набор компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации (ВНИТиБП, РФ); набор препаратов для лабораторной диагностики вируса бешенства методом иммуноферментного анализа (ВНИВИ, РФ). Постановку тестов осуществляли согласно инструкциям изготовителей.

Для изоляции вируса использовали кроликов 3-4 мес. возраста, которым вводили интрацеребрально по 0,2 см3 надосадка 20%-ной суспензии патологического материала. Наблюдение за животными и учет клинических признаков осуществляли в течение 40 суток. У павших и находящихся в агональном состоянии кроликов, а также по истечению 40 суток у клинически здоровых животных отбирали пробы слюны и мозга.

Гемагглютинирущую активность определяли в тесте прямой гемагглютинации с использованием эритроцитов гуся [5]. Инфекционную активность определяли титрованием на мышах [6]. Титр инфекционности рассчитывали по методу Рида и Менча [7].


Результаты и обсуждение


Результаты исследований по выявлению антигена вируса бешенства в исследованных образцах патологического материала представлены в таблице 1.


Таблица 1

Результаты РДП, ИФА и МФА по выявлению антигена вируса бешенства





Исследуемый материал

Титр антигена

РДП, лог2

ИФА, разведение

МФА, +

20%-ная суспензия мозга козла, «Матыбулак»

-

-

-

20%-ная суспензия мозга овцы, «Матыбулак-1»

0,5

1:2560

++++

20%-ная суспензия мозга овцы, «Матыбулак-2»

0,5

1:1028

++--

слюна овцы,

«Матыбулак-2»

0,5

1:2560

+++-

20%-ная суспензия мозга КРС, «Актерек»

0,5

1:40

++--

20%-ная суспензия мозга КРС, «Всеобод»

1,0

1:80

++--

20%-ная суспензия мозга КРС, «Бустон»

3,0

1:320

+---

20%-ная суспензия мозга лисы, «Лиса-1»

3,0

1:1028

++++

слюна лисы,

«Лиса-1»

1,0

1:512

+++-

20%-ная суспензия мозга лисы, «Лиса-2»

-

-

-

20%-ная суспензия мозга КРС, «РАШТ»

3,0

1:1280

++++

20%-ная суспензия мозга корсака, «Корсак»

-

-

-


Из данных таблицы 1 видно, что в тестах РДП, ИФА и МФА в патологических материалах «Матыбулак-1», «Актерек», «Всеобод», «Бустон», «РАШТ», «Лиса-1» и в образце слюны «Матыбулак-2» был обнаружен антиген вируса бешенства. Изначально в патологических материалах «Всеобод» и «Бустон» отмечались следы аутолиза, что объясняет сниженные титры антигена в проведенных тестах по сравнению с активностью антигена, выявленного в образцах патологических материалов без признаков разложения. Результаты выявления антигена в патологических материалах были также подтверждены с использованием коммерческих наборов для лабораторной диагностики бешенства ВНИИТиБП и ВНИВИ. В мозговых суспензиях «Матыбулак», «Лиса-2», «Корсак» антиген не выявлен, поэтому данные материалы не использовались в дальнейших исследованиях.

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов [8]. На основании положительных результатов трех тестов, в образцах патологического материала «Матыбулак-1», «Матыбулак-2», «Актерек», «Всеобод», «Бустон», «Лиса-1», «РАШТ», был выявлен рабический антиген и поставлен диагноз - бешенство.

Одними из основных свойств, характеризующих возбудитель бешенства, являются его патогенность и инкубационный период. В зависимости от продолжительности инкубационного периода различают фиксированные и уличные варианты вируса. Инкубационный период при интрацеребральном введении фиксированного вируса бешенства составляет 5-10 дней, в отличие от уличного, который длится от 14-40 дней и больше [9]. По патогенным свойствам фиксированные штаммы, в виду своей аттенуации, имеют слабую или среднюю вирулентность, а уличные варианты относят к высоковирулентным вариантам вируса. Для уличных штаммов характерно накопление вируса в слюнных железах и выделение его со слюной, фиксированные штаммы не обнаруживаются в слюне. Для изучения данных свойств возбудителя бешенства необходима изоляция вируса [9, 10].

К настоящему времени большинство исследователей изолируют вирус в культуре клеток, что снижает затраты на проявление теста и не требует использование животных, но в то же время не дает возможности моделировать заболевания, выявлять характер клинических симптомов, учитывать длительность инкубационного периода. Поэтому свои исследования по выделению изолятов вируса бешенства проводили на животных. По результатам исследований отдельных авторов выделение вируса на кроликах не уступает по чувствительности тесту по выделению вируса бешенства на мышах при изучении классических вариантов вируса бешенства. В то же время имеет при изоляции лиссаподобных вариантов вируса [11].

Результаты интрацеребрального заражения кроликов представлены в таблице 2.


Таблица 2

Результаты заражения кроликов уличным вирусом бешенства





Группа живот-ных

Используемый материал

Кол. гол.

Инкубационный период,

наличие клинических симптомов

Пало/всего

I

«Матыбулак-2»

4

с 14 по 17 сутки, с клиническими симптомами

4/4

II

«Актерек»

4

животные не заболели

0/4

III

«Всеобод»

4

пали 2 кролика на 20-21 сутки,

с клиническими симптомами

2/4

IV

«Бустон»

4

пали 2 кролика на 20 - 22 сутки,

с клиническими симптомами

2/4

V

«Лиса»

4

с 14 по 17 сутки с клиническими симптомами

4/4

VI

«РАШТ»

4

с 20 по 23 сутки, с клиническими симптомами

4/4


Из результатов таблицы 2 видно, что при заражении животных патологическими материалами «Матыбулак-2» и «Лиса» клинические симптомы начали проявляться на 14 сутки, а у групп животных, зараженных патологическими материалами «Всеобод», «Бустон», «РАШТ» - на 20 сутки после введения материала. Первые признаки заболевания характеризовались изменением поведения, отсутствием аппетита, беспорядочным перемещением по клетке, шаткой походкой, связанной с тремором и парезами задних конечностей. В среднем через одни сутки после появления первых симптомов наблюдали клинику, соответствующую прогрессирующим полиэнцефалитам, проявляющимся в заваливании животных на бок, расширении зрачков глаз, запрокидывании головы и частичной потерей чувствительности конечностей. К третьим суткам болезни большая часть животных были обездвижены вследствие развития восходящих параличей, отмечалось помутнение роговицы глаз и полная потеря чувствительности конечностей. Вне зависимости от использующихся вариантов вируса зараженные животные погибали не позже, чем через 72 часа от регистрации проявления первых клинических признаков.

В третьей и четвертой группе по 2 из 4 животных не заболели, что, вероятно, связано с низкой инфекционной активностью первоначальных патологических материалов. Животные второй группы не заболели, что свидетельствует о полной утрате инфекционной активности патологического материала.

Следует отметить, что инкубационный период после заражения кроликов таджикистанским патологическим материалом был длительней инкубационного периода заболевания у кроликов, инокулированных материалом, отобранным в Казахстане, в среднем на 7 суток. Кроме того, у кроликов, зараженных казахстанскими вариантами вируса, отмечена обильная саливация (группа 1, 5).

Для подтверждения специфичности клинических признаков и гибели животных, суспензии мозга павших и умерщвленных кроликов исследовались в РДП, МФА, ИФА, РГА. Титр инфекционной активности определяли титрованием на белых мышах. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты исследования суспензий мозга


павших и умерщвленных кроликов


Наименование

патологического материала

Коли-чество живот

ных

Титр антигена, разведение

Титр вируса,

lg МЛД50 /0,03 см3, n=3


РДП

ИФА

МФА

РГА

«Матыбулак-2»

4

1:2÷1:8

1:512÷1:2560

++++

1:32÷1:64

4,25+0,08

«Всеобод»

2

ц÷ 1:2

1:512

++++

1:2÷1:16

3,25+0,25

2

-

-

-

-

н/и

«Бустон»

2

ц÷ 1:2

1:512÷1:1024

++++

1:2÷1:8

2,25+0,08

2

-

-

-

-




«Лиса»

4

1:2÷1:4

1:512÷1:2560

++++

1:8÷1:32

3,75+0,14

«РАШТ»

4

1:2÷1:8

1:512÷1:1024

++++

1:8÷1:16

3,00+0,25

«Актерек»

4

-

-

-

-

н/и


Из данных таблицы 3 видно, что в пробах, полученных от кроликов заболевших и павших с характерными клиническими симптомами, выявлен антиген вируса бешенства в тестах РДП, ИФА, МФА и РГА. В пробах, полученных от кроликов, умерщвленных на 40 день после заражения, антиген вируса бешенства не выявлен. В то же время для положительных проб определен титр инфекционности, который составил для пробы «Матыбулак-2» - 4,25 lg МЛД50 /0,03 см3, «Всеобод» - 3,25 lg МЛД50 /0,03 см3, «Лиса» - 3,75 lg МЛД50 /0,03 см3, «РАШТ» - 3,00 lg МЛД50 /0,03 см3, «Бустон» - 2,25 lg МЛД50 /0,03 см3. Полученные результаты по антигенной активности с использованием тестов РДП, ИФА, МФА и РГА и инфекционности полученных изолятов уличных вариантов вируса бешенства соответствовали результатам, описанным в литературе [9-11].

Таким образом, были изолированы пять вариантов уличного вируса бешенства из патологических материалов, отобранных от МРС, КРС, лисы в Республике Казахстан и Таджикистан в 2007-2011 гг. Изучены их антигенные свойства и определена инфекционная активность. Оформлены паспорта на изоляты «РАШТ» (РАШТ), «SVR-F1-2011» (Лиса), «SVR-C1-2007» (Всеобод), «SVR-S1-2008» (Матыбулак-2), «Бустон» (Бустон). На выделенные изоляты вируса бешенства оформлены паспорта, после чего материал депонирован в «Коллекции микроорганизмов» НИИПББ.

Заключение


При исследовании 12 образцов патологических материалов от КРС, МРС и диких плотоядных с использованием диагностических тестов РДП, МФА, ИФА выявлено девять положительных проб от семи животных. В результате изоляции на кроликах выделено 5 вариантов уличного вируса бешенства. Определена их антигенная и инфекционная активность. Полученные изоляты депонированы в «Коллекции микроорганизмов» НИИПББ.

Выделенные изоляты вируса бешенства после проведения антигенного и генетического типирования планируется использовать для контроля эффективности диагностических и профилактических средств используемых в Республике Казахстан.

Литература





  1. Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., Селимов М.А., Янбарисова С.Р. Разработка и внедрение экспресс-методов иммунологического мониторинга при бешенстве // Вопросы вирусологии. - 2001. - № 5. - С. 45–48.

  2. Росляков А.А, Мамадалиев С.М., Троицкий Е.Н. и др. Эпидемиологические аспекты природной очаговости бешенства в Казахстане. Противоэпизоотические мероприятия и факторы, определяющие их эффективность // Мат. междунар. науч-практ. конференции, посвящен. 50-летию НИИПББ НЦБ МОН РК. - Алматы, 2008. - С. 572-575.

  3. Татаров А.Г., Хисматуллина Н.А., Селимов М.А. Выделение рабического вируса и экспресс-диагностика бешенства в культуре перевиваемых клеток невриномы Гассерова узла крысы // Вопросы вирусологии. - 1987. - № 5. - С. 619–622.

  4. Хисматуллина Н.А. Разработка и усовершенствование лабораторных методов диагностики бешенства: автореф. … канд. биол. наук. - Казань, 1989. - 21 с.

  5. Kuwert Е., Wictor Т., Sokol F., Koprowski Н. - Hemagglutination by rabies virus. //J.Virol, 1978, 2,138I-I392.

  6. Юсупов Р.Х., Хисматуллина Н.А., Селимов М.А. Оценка эффективности методов выделения уличных штаммов вируса бешенства в биологических системах // Ветеринария. - 1989. - № 4. - С. 27–30.

  7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологии. - Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

  8. Kaplan, H. Koprowski // WHO 4-thed. - Geneva, 1996. - P. 476.

  9. Hamir A.N., Moser, G. & Rupprecht, C.E. Clinicopathological variation in raccoons infected with different street rabies virus isolates/ // 1996. - V. 8- P. 31-37.

  10. Янбарисова С.Р. Сравнение традиционных и экспресс-методов лабораторной диагностики бешенства // Ветеринарная медицина. – С. 90-91.

  11. Чернов А.Н., Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х. Изучение биологических свойств изолятов вируса бешенства, циркулирующих в эпизоотических очагах Республики Татарстан // Мат. межд. научно-практич. конф., посв. 40-летию ВНИИВВиМ. – Покров, 1998. - С.78-79.



Түйін



Бұл мақалада құтырық вирусының дала изоляттарын бөліп алу және идентификациялауға арналған тәжiрибелердiң нәтижелерi көрсетілген. Ми және сілекей сынамаларында диффузды преципитация реакциясында, антиденелердi флуоресценциялау және иммунды ферментік талдау әдiсітерін қолдана отырып патологиялық материалдарда құтырық вирусының қарсы денелері бар болуы анықталған. Патологиялық материалдардан құтырық вирусын бөліп алып қояндарды жұқтыру жолымен алынған. Зерттеу барысында құтырық вирусының зардаптылық және антигендік қасиеттері мен індеттік белсенділігі көрсетілген.


Summary


The article presents the results of experiments on the identification and isolation of rabies virus isolates. With the use of diffusion precipitation reaction, immunofluorescence method, enzymoimmunoassay in the brain and saliva samples, it was established the presence of antigen of the rabies virus in pathological materials. The isolation of rabies virus from pathological materials was held by the isolation in the rabbits. In the course of the research pathogens and antigenic properties were studied, also infectious activity of the isolated rabies virus isolates have been established.


Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУдк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа
Ргп «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» кн мон рк, пгт. Гвардейский, Кордайский район, Жамбылская...

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУдк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУдк 616. 083. 98: 615. 11 Ббк 53. 5-55. 14 Б74

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУдк 619: 616. 981. 55: 636. 2

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУдк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУчебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев, А. А. Щербаков, Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин удк 619: 616

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУчебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев А. А. Щербаков Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин > И. Г. Швиденко удк 619: 616

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconРекомендации удк 619: 616. 9-085: 579. 852. 13Н эффективность препаратов при некробактериозе животных // Молочное и мясное скотоводство. 2006. №4. С. 39-41

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУдк 619: 616-07 Метод выделения ДНК и тест-система пцр в реальном времени для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства iconУдк: 616-017. 1: 616. 33/34-085

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU