Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных icon

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных





НазваниеСтароверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных
страница1/3
Дата конвертации12.06.2013
Размер0.89 Mb.
ТипДокументы
  1   2   3
На правах рукописи


СТАРОВЕРОВ
Сергей Александрович



Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных


03.00.04 – биохимия

16.00.04 – ветеринарная фармакология с токсикологией


А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук


Саратов – 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)


Научный консультант

доктор биологических наук

Дыкман Лев Абрамович


Официальные оппоненты:


доктор биологических наук

старший научный сотрудник

Соколов Олег Игоревич





доктор ветеринарных наук, доцент

Домницкий Иван Юрьевич





доктор ветеринарных наук, профессор

Жолобова Инна Сергеевна


Ведущая организация:

ФГУ Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных



Защита состоится «23» декабря 2009 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13, Тел./факс (8452)970383).


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.


Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК.


Автореферат разослан «___» ноября 2009 г.


Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время большое внимание исследователей в различных отраслях знаний уделяется оценкам новых возможностей, возникающих в связи с бурным развитием нанотехнологий. В том числе, это касается биохимии и фармакологии, где уникальные свойства наноструктурированных объектов создают весьма благоприятную основу для конструирования новых типов диагностических систем и лекарственных форм.

В литературе отмечается все больше сведений о применении носителей нанометрового диапазона в качестве средств доставки антигенных и лекарственных веществ к иммунокомпетентным клеткам и пораженным органам макроорганизма. Эти результаты позволяют надеяться, что с помощью подобных систем можно значительно снизить токсичность и повысить эффективность действия традиционно используемых лекарственных препаратов. Весьма перспективным, в частности, оказывается применение наночастиц в качестве составных частей потенциальных лекарственных форм для конструирования противоопухолевых, противогрибковых, бактерицидных и антивирусных препаратов. Кроме того, в последнее время активно развиваются исследования, имеющие целью разработку вакцинных препаратов на основе нанометровых носителей и их применение в медицине и ветеринарии (Han et al., 2007).

В качестве корпускулярных носителей для биологически активных веществ используются такие структуры, как фуллерены и дендримеры, липосомы, полиакрилатные частицы, мицеллы, коллоидное золото (КЗ) и др. Известно, в частности, что инъекционное введение лабораторным животным КЗ может приводить к его накоплению в ретикулярных клетках лимфоидной ткани, активации клеточного и гуморального иммунного ответа (Дыкман, Богатырев, 2007). Кроме того, КЗ применяют как вектор для непосредственного внесения лекарственных веществ в очаги воспаления и в пораженные органы макроорганизма (Kattumuri et al., 2007).

Была показана возможность применения КЗ для терапевтического воздействия на злокачественные новообразования (Paciotti, 2004; El-Sayed, 2005). Исследователи наносили на поверхность коллоидной частицы фактор некроза опухолей и вводили полученный конъюгат пораженным опухолями мышам. В итоге было установлено, что комплекс КЗ с фактором некроза менее токсичен и более эффективен в терапевтическом воздействии на опухоль по сравнению с нативным фактором, несмотря на то, что конъюгированный с золотыми наночастицами фактор вводился в организм в меньшей дозе. Однако биодинамика золотых частиц, вводимых в организм, изучена недостаточно. В известных работах авторы отмечают (Eisler, 2004; Li et al., 2007), что частицы КЗ захватываются гепатоцитами, секретируются желчью и выводятся из организма с каловыми массами.

Конструирование терапевтических препаратов на основе мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ) также находит все более широкое применение в современной ветеринарной медицине (You et al., 2007; Lo et al., 2007). Это связано с тем, что данная корпускулярная система позволяет использовать лекарственные субстанции, обладающие ярко выраженными гидрофобными свойствами.

Введение активного вещества в эту систему в ряде случаев приводит к повышению биодоступности лекарственной формы, что способствует более высокой терапевтической активности и снижению дозировки препарата. Поэтому препараты, сконструированные на данной основе, обладают меньшей токсичностью.

Таким образом, приведенное выше краткое резюме результатов проведенного нами анализа литературных данных свидетельствует об актуальности темы данной диссертации. Этот анализ позволяет также констатировать, что ко времени начала наших исследований в этой области наблюдался дефицит сведении по:

а) молекулярным и клеточным механизмам иммуномодулирующего действия наночастиц в составе комплексов с широким спектром разнообразных антигенов и примерам их использования для получения in vivo поликлональных антител к низкомолекулярным веществам (гаптенам);

б) эффектам взаимодействий коньюгатов КЗ с антигенами (низкомолекулярными и высокомолекулярными) с имунокомпетентными клетками, а также аналогичным данным при использовании в качестве наноструктурированных носителей антигенов мицеллярных структур;

в) примерам конструирования препаратов на мицеллярной и мицеллярно-гелевой основе и их применению в ветеринарной медицине.

Целью нашей работы было изучение механизмов взаимодействия высоко- и низкомолекулярных антигенов, ассоциированных с корпускулярными носителями (коллоидное золото и мицеллы), с клетками ретикулоэндотелиальной системы, разработка основ конструирования фармацевтических композиций с применением данных наноструктур и изучение их фармакодинамических свойств.

В соответствии с данной целью, в работе решались следующие основные задачи:

  1. С использованием золотых наночастиц в качестве носителя антигенов и адъюванта получить поликлональные антитела против ряда лекарственных веществ (ивермектин, кленбутерол, диминазен) для их детектирования и анализа фармакодинамики в биологических жидкостях животных.

  2. Исследовать особенности взаимодействий коньюгатов коллоидного золота с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценить эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов.

  3. Исследовать особенности взаимодействий комплексов мицеллярных структур с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценить эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов.

  4. Разработать физико-химические основы получения новой мицеллярной инъекционной лекарственной формы диминазена с применением неионогенного поверхностно-активного вещества, оценить его фармакологические характеристики и терапевтические свойства.

  5. Разработать физико-химические основы получения новой мицеллярно-гелевой формы ивермектина для наружного применения, оценить его фармакологические характеристики и терапевтические свойства.

В ходе реализации этой цели и задач были получены результаты, научная новизна которых заключается в следующем:

- впервые с применением коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта получены поликлональные антитела к низкомолекулярным веществам (ивермектин, диминазен и кленбутерол), использованные для определения и анализа ивермектина и диминазена в биологических жидкостях животных;

- впервые получены экспериментальные результаты, характеризующие взаимодействие низко- и высокомолекулярных веществ, коньюгированных с золотыми наночастицами, либо ассоциированных с мицеллами ПАВ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценены эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов;

- разработана новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена, проведено изучение ее фармакологических и фармакодинамических свойств;

- сконструирована новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма для наружного применения на основе ивермектина, проведено изучение ее фармакологических и фармакодинамических свойств.

Полученные результаты имеют также определенную практическую значимость. Прежде всего, это касается данных об особенностях взаимодействий комплексов антигенов с использованными наночастицами с иммунокомпетентными клетками, позволяющих судить о возможных механизмах их иммуномодулирующих свойств. Это делает более эффективным решение задач получения iv vivo поликлональных антител к слабоиммуногенным антигенам, а также открывает перспективу разработке вакцин нового поколения. В частности, нами были разработаны и защищены патентами РФ адъювант для вакцин на основе мицеллярных структур и адъювант на основе КЗ. Кроме того, на основе сконструированной и защищенной патентом РФ лекарственной формы разработана фармацевтическая композиция для лечения заболеваний микробной и паразитарной этиологии. На основе данной композиции создано два препарата, прошедшие регистрацию и допущенные к производству как противопаразитарные и антимаститные гели. Был разработан и защищен патентом РФ препарат для лечения заболеваний кровепаразитарной этиологии. Данный инъекционный препарат прошел регистрацию и допущен к производству. Результаты работы были представлены на Втором саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций, 2006 г., ряде российских и региональных выставок.

На защиту выносятся следующие основные положения:

  1. Использование коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта обеспечивает получение in vivo поликлональных антител против лекарственных веществ ивермектина, кленбутерола и диминазена, которые могут быть использованы для определения данных соединений в биологических жидкостях животных.

  2. Взаимодействие конъюгатов золотых наночастиц с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки и вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов. Накопление низкомолекулярных веществ в фагоцитирующих клетках в присутствии наночастиц золота происходит более интенсивно. При этом само коллоидное золото вызывает повышение дыхательной активности макрофагов.

  3. Взаимодействие комплексов мицелл, полученных на основе неионогенных ПАВ, с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки и вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов. Накопление низкомолекулярных веществ в фагоцитирующих клетках в присутствии мицеллярных наночастиц происходит более интенсивно. При этом сами неионогенные ПАВ активно проникают через мембраны клеток в цитоплазматическое пространство.

  4. Разработанная новая инъекционная мицеллярная лекарственная форма диминазена (Неозидин М) является стабильной и обладает высокой терапевтической эффективностью.

  5. Разработанная новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма ивермектина для наружного применения (Ивермек-гель) является стабильной и обладает высокой терапевтической эффективностью.

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: “Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений”, научный руководитель д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; “Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями”, научный руководитель д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01200606177.

Частично настоящая работа получила финансовую поддержку РФФИ (гранты №№ 04-04-48224-а; 07-04-00301-а; 07-04-00302-а); МНТЦ (проект № 2426); Федерального агентства по науке и инновациям (гос. контракт № 02.513.11.3028); Президиума РАН (проект в рамках программы фундаментальных исследований “Фундаментальные науки – медицине”).

Часть работы была выполнена на базе научно-исследовательского отдела ЗАО “Нита-Фарм” и Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с д.б.н. Дыкманом Л.А.. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору данной диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.

В исследованиях также принимали участие сотрудники группы иммунотехнологии лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН аспиранты Видяшева И.В., Зайцева И.С. и Пристенский Д.В. А также сотрудники ЗАО “Нита-Фарм” Аксиненко Н.М., Василенко О.А., Габалов К.П., Ермилов Д.Н., Жемеричкин Д.А., Сазонов А.А., Семенов С.В., Сидоркин В.А., Сынкин С.Ю., Шведова О.В. и Улизко М.А. Всем им автор выражает глубокую благодарность.

Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы д.х.н. профессора С.Ю. Щеголева (ИБФРМ РАН) за интересное и полезное обсуждение результатов на всех ее этапах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлялись, докладывались и обсуждались на: межд. науч. конф. “Биотехнология на рубеже двух тысячелетий”, Саранск, 2001; VIII Всеросс. съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002; I и III межрег. конф. молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой”, Саратов, 2002, 2006; 6, 7 и 8 John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, Pushchino, Russia, 2002, 2005, 2007; 1 и 5 межд. конгр. “Биотехнология – состояние и перспективы развития”, Москва, 2002, 2009; VIII Int. Conf. “The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology”, Saratov, Russia, 2003; науч. конф. “Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями”, Москва, 2003, 2004, 2005; межд. науч.-практ. конф. “Актуальные проблемы инвазионной, инфекционной и незаразной патологии животных”, Ставрополь, 2003; межд. конф. “Основные достижения и перспективы развития паразитологии”, Москва, 2004; межд. науч.-практич. конф. “Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики борьбы с паразитарными и инфекционными болезнями сельскохозяйственных животных”, Уфа, 2004; X Всеросс. конф. “Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов”, Саратов, 2004; 9 межд. школе-конф. молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино, 2005; Всеросс. конф. “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты”, Саратов, 2005; Saratov Fall Meeting, Workshop on Nanobiophotonics I, II, III, IV, Saratov, Russia, 2005, 2006, 2007, 2008; межд. науч.-практ. конф. “Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных”, Ульяновск, 2006; межрег. науч. конф., посвященной 119-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, Саратов, 2006; межд. науч. конф. “Микробные биотехнологии”, Одесса, Украина, 2006; VI Всеросс. конф. молодых ученых “Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии”, Саратов, 2007; 15 межд. науч. конф. “Высокие технологии в биологии, медицине и геоэкологии”, Новороссийск, 2007; 10 Analytical Russia-German-Ukrainian Symp., Saratov, Russia, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 83 печатные работы, в том числе 4 патента, 23 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, 16 статей в отечественных и зарубежных сборниках научных трудов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей три главы, заключения и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 303 страницах, иллюстрирована 71 рисунком и включает 71 таблицу. Список использованных литературных источников содержит 440 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой литературный обзор, в котором рассмотрены и проанализированы современные сведения об иммунной системе. Подробно обсуждены свойства и применение в медицине и биологии конъюгатов золотых наночастиц. Приведены данные о самоорганизующихся системах на основе поверхностно активных веществ, их физико-химических и биологических свойствах. Особое внимание уделено анализу современных аспектов конструирования лекарственных средств на основе воднодисперсных и мицеллярно-гелевых структур, их применению в ветеринарии и медицине.

Сведения об использованных материалах и методах изложены во второй главе. Кроме того, некоторые оригинальные методики представлены в соответствующих разделах третьей главы. Во второй главе подробно описаны процедуры получения перитонеальных макрофагов и лимфоцитов периферической крови и их использование для изучения иммунного ответа in vitro. Приведены методики иммунизации животных и получения антител in vivo с применением в качестве носителя антигенов наночастиц золота и in vitro – путем селекции специфичных клонов из комбинаторных фаговых библиотек миниантител. Подробно изложена методология иммуноцитохимического анализа с использованием флуоресцентной микроскопии. Большое внимание уделено количественному определению лекарственных веществ хроматографическим (ВЭЖХ) и спектроскопическими (УФ, ИК) методами. Отдельно описаны процедуры синтеза золотых наночастиц и получения на их основе конъюгатов с гаптенами. Кроме того, приведены методики конъюгации гаптенов с белками-носителями. Оценка изменения дыхательной активности клеток проводилась по способности клеток восстанавливать нитротетразолевый синий бромид до формазана (МТТ-тест) по общепринятому методу (Bernas, Dobrucki, 2000) с небольшими модификациями.

Оригинальные методики получения мицеллярных растворов лекарственных веществ и определения их остаточного уровня в биологических жидкостях животных изложены во второй главе диссертации в виде подробных протоколов.

Глава 3. Результаты и обсуждение собственных исследований

3.1. Получение поликлональных антител к ивермектину и его детекция в биологических жидкостях животных

Ивермектин – макроциклический дисахарид противопаразитарного действия, представляет собой дигидропроизводное авермектинов В и В1в, вырабатываемых грибами Streptomyces avermitilis. Препараты, содержащие в качестве активного вещества ивермектин, широко распространены как в растениеводстве, так и в ветеринарии из-за их широкого спектра действия на вредителей растений и паразитов животных (Li et al., 1997; Fink, 1988).

С момента появления лекарственных форм ивермектина стали активно разрабатываться методы его выявления в органах и тканях, сыворотке крови и молоке. Однако многие из этих методов не удовлетворяют исследователей из-за своей сложности, малой чувствительности или трудности в адаптации к современной материально-технической базе. Поэтому мы оценили возможность получения антител к ивермектину при использовании различных корпускулярных носителей для решения задач его определения в сыворотке крови животных и в продуктах ветеринарно-санитарного надзора после применения различных лекарственных средств на его основе.

В начальной стадии наших исследований мы столкнулись со сложностью детекции ивермектина в биологических жидкостях животных при использовании ВЭЖХ. Хроматографические методы определения ивермектина, описанные в литературе (Rabel et al., 1993; Fink et al., 1996; Cerkvenik et al., 2001; Anastasio et al., 2002), основаны на очистке биологического образца путем жидкостной и/или твердофазной экстракции, дериватизации экстрагированного ивермектина в неводном растворителе для получения флуоресцентного производного и ВЭЖХ анализе с флуориметрическим детектированием при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 нм и 470 нм соответственно. Для улучшения метрологических характеристик метода применяется внутренний стандарт – абамектин. Однако мы не смогли в нашей лаборатории непосредственно воспроизвести указанные методы по причине присутствия на хроматограммах холостых образцов (образцов, не содержащих ивермектин) хроматографического пика, совпадающего по Rf с флуоресцентным производным ивермектина (компонент В). Присутствие такого пика, свидетельствующего о наличии примеси, делает невозможным определение концентрации ивермектина ниже 50 нг/мл.

Для решения этой проблемы нами был подобран растворитель (метилтретбутиловый эфир), в котором растворимы 1-метил-имидазол, трифторуксусный ангидрид, ивермектин, абамектин, а также флуоресцентные производные ивермектина и абамектина, но не растворима примесь. Для учета количества ивермектина, связанного с эритроцитами, в нашем варианте абамектин добавляют непосредственно в кровь, а анализируется не сыворотка, а плазма.

Разработанный нами протокол был использован для определения ивермектина в образцах крови и молока крупного рогатого скота после применения ивермектин-содержащих препаратов. Диапазон обнаружения ивермектина в сыворотке крови данным методом составляет от 1 до 200 нг/см3, что соответствует имеющимся литературным данным (Bernal et al., 1994; Hsieh et al., 2003).

Усовершенствовав хроматографический метод детекции ивермектина, мы провели иммунизацию животных различными конъюгатами ивермектина с целью получения антител. Поликлональные антитела, полученные иммунизацией кроликов конъюгатами ивермектина с КЗ и белком, были протестированы методом иммуно-дот анализа. Установлено, что все полученные антисыворотки взаимодействовали с гомологичными антигенами и имели высокую специфичность. Чувствительность полученных сывороток в дот-анализе составила 0.3 нг. Методом иммуноферментного анализа был определен титр полученных сывороток. При обоих вариантах иммунизации титр сывороток оказался примерно одинаковым и составил 1:256.

В литературе встречаются работы по получению антител к ивермектину. Так, Crooks с соавт. (1998) проводили детекцию ивермектина в печени крупного рогатого скота с использованием иммуноферментного анализа. Для получения антител авторы готовили конъюгаты ивермектина с апо-трансферином. Полученным конъюгатом, смешанным с полным адъювантом Фрейнда, проводили иммунизацию кроликов. Авторы отмечают высокое качество полученных антител, а так же большую чувствительность разработанного метода. Однако необходимо отметить сложность приготовления конъюгата ивермектин/белок. В нашей работе из-за гидрофобности ивермектина реакцию проводили не в буферной системе, а в органическом растворителе, что влекло за собой денатурацию белковой фракции конъюгата.

В работах (Mitsui et al., 1996; Samsonova et al., 2002; Li et al., 1997) антитела также получены при использовании конъюгатов ивермектина с белковым носителем. Чувствительность выявления антигена в этих методах колебалась от 0.3 до 10 нг/мл, что соответствует полученным нами данным. Однако, при использовании нами конъюгата ивермектин-КЗ значительно упрощаются процедуры иммунизации и исключается этап очистки полученных сывороток от сопутствующих антител против эпитопов белка-носителя.

Полученные сыворотки были использованы нами для детекции ивермектина в крови и молоке коров, которым препарат вводился однократно в терапевтической дозе. Исследуемые биологические жидкости (плазму крови и молоко) наносили непосредственно на ПВДФ мембрану. В качестве отрицательного контроля использовали плазму крови и молоко животных контрольной группы (препарат не вводился). Параллельно с иммуноанализом пробы исследовали методом ВЭЖХ.

На рис. 1 представлен график изменения концентрации ивермектина в образцах крови, полученный методом ВЭЖХ. Концентрация ивермектина в пробах крови, отобранных через 2, 4, 8, 24 и 75 ч составила 60, 161, 104, 92 и 30 нг/мл соответственно. Результаты иммуно-дот анализа проб плазмы крови оказались сопоставимы с хроматографическим методом. Необходимо отметить, что хроматографический и иммунологический методы обладают сравнимой чувствительностью и диапазоном определяемых концентраций.






К+(1) К+(2) 60 нг 161 нг 104нг 92 нг 30 нг К-(1) К-(2)


Рис. 1. Изменение концентрации ивермектина в крови после его внутримышечного введения животным.

После проведения работы по обнаружению ивермектина в плазме крови мы провели аналогичные исследования по детекции ивермектина в молоке (рис. 2). Измерение препарата в молоке проводили через 1, 3, 6, 24, 48 и 72 ч после введения препарата. Концентрация ивермектина составила 33, 45, 56, 112, 109 и 66 нг/мл соответственно. Таким образом, также как и в плазме крови, ивермектин выявляется в молоке как хроматографическим, так и иммунологическим методом.






К- 33 нг 45 нг 56 нг 112 нг 109 нг 66 нг К+(1) К+(2)

Рис. 2. Изменение концентрации ивермектина в молоке после его внутримышечного введения животным.

Несмотря на то, что дот-анализ позволяет зарегистрировать лишь присутствие определяемого препарата в пробе и относительное изменение его концентрации (по интенсивности окраски дота), данный метод отличает экспрессность, простота пробоподготовки, доступность используемого оборудования и материалов.

На следующем этапе мы расширили эти исследования на другие низкомолекулярные вещества, обладающие иными физико-химическими свойствами.

3.2. Получение поликлональных антител к диминазену

Среди многочисленных лекарственных субстанций несомненный интерес представляют препараты, воздействующие на возбудителей кровепаразитарных болезней, вызываемых как жгутиковыми простейшими (трипаносомы), так и представителями класса Piroplasmida (бабезии, тейлерии, цитоксзооны) у различных видов домашних и диких животных, поскольку данные возбудители являются внутриклеточными паразитами. Для этих целей наиболее часто используются препараты, относящиеся к группе ароматических диамидинов. Наиболее распространенным ветеринарным препаратом, используемым для борьбы с данными возбудителями, является диминазен ацетурат – 4, 4/ бензинодиазоаминодиамидин диацетурат (Brodersen et al., 1958; Homer et al., 2000) и его лекарственная форма в смеси с антипирином – беренил.

Получение антител к диминазену связано с преодолением довольно большой сложности получения конъюгатов на данное активное вещество. В последнее время в литературе встречаются работы по получению конъюгатов диминазена на основе липидной матрицы (Olbrich et al., 2002, 2004). В этих работах авторы рассматривали комплекс гидрофильного лекарственного вещества (в данном случае диминазена) и наночастицы на основе липидной матрицы. Рассматривалась также биодинамика и токсичность данного комплекса.

В нашей лаборатории мы не смогли получить устойчивых конъюгатов диминазена с КЗ. Поэтому сначала мы конъюгировали диминазен с бычьим сывороточным альбумином (БСА), а затем получили конъюгат диминазен-белкового комплекса с КЗ, что значительно снизило дозировку при иммунизации. После иммунизации кроликов вышеописанным конъюгатом нами были получены специфические сыворотки, которые были проверены в иммуно-дот методе и иммуноферментном анализе. Чувствительность полученной сыворотки составила 0.6 мкг при титре 1:512.

Получив специфические к диминазену сыворотки, мы проводили с их помощью анализ динамики содержания диминазена в плазме крови телят. В качестве эталонного метода мы использовали ВЭЖХ метод определения диминазена со спектрофотометрическим детектированием. Животных для проведения исследований подбирали по принципу аналогов. Препарат вводили внутримышечно в терапевтической дозе согласно наставлению (3.5 мг/кг). Кровь у животных отбирали через 0.17, 0.35, 0.74 ч, а также через 2, 4, 6, 8 и 9 ч. Иммунологический метод дублировали хроматографическим.

В результате было установлено, что диминазен достигает своей максимальной концентрации в сыворотке крови в течение первого часа после инъекции и составляет 4.33 мкг/мл. В дальнейшем мы наблюдали его постепенное снижение, и к 9 ч его концентрация составляла 0.93 мкг/мл (рис. 3).






1.75 мкг 4 мкг 4.3 мкг 3.5 мкг 2.4 мкг 1.6 мкг 1.2 мкг 1 мкг К+(1) К+(2) К-

Рис. 3. Кинетика содержания диминазена в плазме крови телят.

Полученные нами результаты определения диминазена методом ВЭЖХ частично совпадают с аналогичными данными по кинетике содержания деминазена, приведенными в работах (Aliu et al., 1993; Rampal, Chaudhary, 2000). Однако пик максимума диминазена в данных работах был немного выше, что, по-видимому, связано с видовыми и климатическими (работы проводились в ЮАР и Индии) особенностями.

При сравнении хроматографических данных по фармакокинетике с данными иммуно-дот метода можно отметить, что наиболее четкая детекция диминазена наблюдается в диапазоне от 3.55 до 0.90 мкг/мл (рис. 4), в больших концентрациях наблюдается слияние окраски пятен, что приводит к сложности определения больших концентраций диминазена в образцах.

3.3. Получение поликлональных антител к кленбутеролу

Кленбутерол (4-амино-(t-бутиламино) метил)-3,5-дихлоробензил алкоголь гидрохлорид) относится к группе лекарств, воздействующих на 2-адренорецепторы (Авакян, 1988), и используется как бронхорасширяющий препарат в медицине и ветеринарии (Ramos et al., 2003). В нетерапевтических дозах эти препараты могут быть рассмотрены как допинг-агенты в спорте. Повышенная доза этого лекарства имеет липолитический и анаболический эффект. Фактически 2-агонисты могут незаконно использоваться как стимуляторы роста в животноводстве (Cojmerac et al., 2000; Schiavone et al., 2004). Остатки таких препаратов могут накапливаться в больших количествах в ливере и мясе, что может делать эти продукты токсичными для человека (Vela et al., 2001; Traynor et al., 2003).

Детекцию кленбутерола в настоящее время осуществляют при помощи газовой хроматографии (Batjoens et al., 1996), капиллярного электрофореза (Vela et al., 2001), высокоэффективной жидкостной хроматографии (Bazylak, Nagels, 2002). Имеются также данные по разработке иммуноферментных и иммунохроматографических тест-систем к кленбутеролу (Shelver, Smith, 2000; Zhao et al. 2004; Liu, 2004; Zhang et al., 2006).

Хотя в отношении кленбутерола имеется довольно большое количество методов детектирования, методы с использованием антител, все-таки, обладают определенной привлекательностью для исследователей. Поэтому мы поставили перед собой задачу изучить возможность применения конъюгатов кленбутерола с КЗ для получения антител и исследовать их специфичность.

Мы провели конъюгирование кленбутерола с КЗ (кленбутерол-КЗ) и бычьим сывороточным альбумином (кленбутерол-БСА) и иммунизировали полученными конъюгатами кроликов. После иммунизации кроликов конъюгатами титр антител в полученной сыворотке составил, как для кленбутерол-БСА, так и для кленбутерол-КЗ 1:1024 (рис. 4).

После определения титра антител в полученной сыворотке, проверили их специфичность. Одним из методов определения специфичности антител к кленбутеролу и его аналогам является метод иммуно-дот анализа с использованием конъюгата антикроличьих иммуноглобулинов с КЗ (рис. 5, 6).



Рис. 4. Титр специфических антител в сыворотке кроликов, иммунизированных кленбутеролом, конъюгированным с различными носителями.


1

2

3

4


Рис. 5. Специфичность сыворотки, полученной от кроликов, иммунизированных кленбутеролом, конъюгированным с КЗ (1 – кленбутерол, 2 – тербуталин, 3 – фенотерол, 4 – сальбутамол).


1

2


3


4


Рис. 6. Специфичность сыворотки, полученной от кроликов, иммунизированных кленбутеролом, конъюгированным с БСА (1 – кленбутерол, 2 – тербуталин, 3 – фенотерол, 4 – сальбутамол).

По результатам иммуно-дот анализа видно, что сыворотка, полученная от кролика, иммунизированного конъюгатом КБ-КЗ, более специфична, так как она дает перекрест только с тербуталином, в отличие от сыворотки, полученной от кроликов, иммунизированных конъюгатом КБ-БСА, которая показала перекрест со всеми аналогами кленбутерола.

Таким образом, можно констатировать, что конъюгаты кленбутерола с КЗ вызывают синтез высокоспецифичных антител у кроликов при иммунизации. При этом антитела, полученные данным способом, не уступают по титру антителам, полученным на конъюгаты кленбутерола с белком, но превосходят их по специфичности.

3.4. Изучение взаимодействия конъюгатов гаптен-КЗ с клетками ретикулоэндотелиальной системы

Проведя исследования по получению антител на гаптены, конъюгированные с КЗ, мы поставили перед собой вопросы: как происходит формирование иммунного ответа на КЗ-гаптен на уровне клетки и как происходит взаимодействие конъюгата КЗ-гаптен с клетками ретикулоэндотелиальной системы? Поэтому целью нашей работы на данном этапе было сравнительное исследование накопления лекарственного препарата, иммобилизованного отмеченным выше коллоидным носителем, в лейкоцитах животных.

В результате проведенных экспериментов было установлено следующее. При использовании ивермектина, конъюгированного с КЗ, наибольшая концентрация препарата определялась в перитонеальных макрофагах крыс. Для лимфоцитов цельной крови телят наблюдалось существенное снижение количества препарата в клеточной популяции (табл. 1).

Таблица 1. Концентрация ивермектина в клетках при использовании КЗ как носителя

Вид конъюгата / вид клеток

Внесено ивермектина, мкг

Найдено ивермектина,

мкг ×108

Конъюгат ивермектин+КЗ / перитонеальные макрофаги

45.45

37.13

Конъюгат ивермектин+КЗ / лимфоциты цельной крови

45.45

0.63

Раствор ивермектина / перитонеальные макрофаги

45.45

2.254

Раствор ивермектина / лимфоциты цельной крови

45.45

0.2

Наибольшая концентрация ивермектина была обнаружена при использовании КЗ как носителя низкомолекулярного вещества, что говорит о более эффективном проникновении данного комплекса во внутриклеточное пространство. Кроме того, снижение количества препарата внутри клеточной популяции лимфоцитов, выделенных из цельной крови телят, по-видимому, указывает на фагоцитарный способ проникновения носителей с адсорбированным на нем низкомолекулярным веществом.

Определив концентрацию низкомолекулярного вещества в клеточной популяции, мы поставили перед собой вопросы: как данное вещество распределено в клеточном пространстве? Остается ли данная структура на поверхности клеточной мембраны или проникает во внутриклеточное пространство? Для ответа на эти вопросы были проведены цитохимические исследования препаратов, приготовленных из перитонеальных макрофагов, культивируемых в присутствии КЗ. После культивирования клеток с КЗ в них при помощи миниантител выявляли накопившийся ивермектин. Чтобы определить локализацию исследуемых веществ в клетках, мазки перед окраской обрабатывали холодным ацетоном 2-3 минуты для разрушения липидного слоя клеточных мембран. Тот факт, что при обработке исследуемого объекта ацетоном не происходит снижение интенсивности свечения клеток, выявляемого в люминесцентной микроскопии, может указывать на способность низкомолекулярного вещества, конъюгированного с коллоидным носителем, проникать во внутриклеточное пространство.

Следующим этапом нашей работы стало определение влияния самого КЗ на функциональную активность клеток перитонеальной полости. В эксперименте проводили смешивание конъюгатов КЗ с перитонеальными клетками крыс. Конечное количество клеток в пробе составило 1.0×109/л.

В результате проведенных исследований нами были получены следующие данные. Наибольшее восстановление формазана в МТТ-тесте клетками произошло при их культивировании с КЗ и составило 0.250±0.05 мг/мл. В клетках, культивированных без него, количество восстановленного формазана было значительно ниже и составило 0.062±0.01 мг/мл, соответственно.

Исходя из приведенных выше результатов, можно отметить, что, по-видимому, КЗ способствует повышению дыхательной активности клеток ретикулоэндотелиальной системы и, тем самым, увеличивает фагоцитирующую активность клеток.

Способность наночастиц проникать во внутриклеточное пространство широко комментируется в современной литературе. Так, Borm и Müller-Schulte (2006) в своем обзоре рассматривали применение наночастиц в конструирование инъекционных лекарственных средств и связанные с этим риски. Отмечается зависимость размера частиц от способа их поглощения. При этом для КЗ с размером частиц меньше 39 нм при помощи активного переноса отмечается проникновение через мембрану, что, в принципе, подтверждается нашими результатами, так как обнаружение ивермектина во внутриклеточном пространстве в большем количестве отмечалось в клетках, культивируемых с конъюгатами ивермектина с КЗ. Merchant (1998) рассматривал в своем обзоре роль металлического золота в конструировании жидких лекарственных препаратов. Он высказал предположение о возможности перехода золота из его металлического состояния в форму соли, при том, что влияние этих соединений на стимуляцию физиологических реакций животных организмов известно. О способности КЗ служить носителем лекарственных веществ и, тем самым, способствовать их проникновению в клетки-мишени сообщается в работе (Paciotti et al., 2006). Проведя исследования в данном направлении, мы подтвердили имеющиеся данные, а также установили саму роль коллоидной частицы в способности гаптена накапливаться во внутриклеточном пространстве.

3.5. КЗ как носитель высокомолекулярных антигенов при иммунизации

Следующий этап нашей работы был связан с использованием КЗ как носителя высокомолекулярных антигенов при иммунизации. Для проведения исследований нами были выделены различные антигенные детерминанты из S. thyphymurium (штамм любезно предоставлен нам сотрудниками кафедры ветеринарной микробиологии Саратовского аграрного университета). После проведения электрофореза антигенов и определения их биохимических параметров проводили конъюгацию антигенов с КЗ.

Наиболее оптимальный конъюгат, который удовлетворял определенным экспериментальным требованиям, был получен с ДМСО (диметилсульфоксид)-антигеном (антигенный экстракт, выделенный с использованием ДМСО). Перед конъюгированием с золотом антиген метили флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).



Рис. 7. Клетки, культивированные с антигеном, меченным ФИТЦ, конъюгированным с КЗ

На рис. 7 показаны перитонеальные клетки, культивированные в присутствии антигенов, конъюгированных с КЗ. Зеленое свечение в цитоплазме клеток указывает на проникновение в клеточное пространство антигена, меченного ФИТЦ.

После получения данных результатов, мы сочли целесообразным оценить влияние конъюгатов КЗ с антигеном на функциональную активность ретикулоэндотелиальных клеток. А именно, на возможность активации митохондриального дыхания перитонеальных клеток in vitro. В эксперименте проводили смешивание конъюгатов КЗ с антигенами с перитонеальными клетками крыс. Конечное количество клеток в пробе составило 1.0×109/л.



Рис. 8. Изменение количества восстановленного формазана в культуре перитонеальных клеток in vitro в зависимости от культивирования с конъюгатами КЗ и нативными антигенами.

В результате проведенных исследований нами были получены следующие результаты (рис. 8). Наибольшее восстановление формазана клетками произошло при их культивировании с коньюгатами КЗ+антиген и просто с КЗ и составило 0.263±0.05 мг/мл и 0.250±0.05 мг/мл, соответственно. В клетках, культивированных в присутствии нативного антигена и без него, количество восстановленного формазана было значительно ниже и составило 0.151±0.03 и 0.062±0.01 мг/мл, соответственно.

Подобные эксперименты были проведены также на белых лабораторных нелинейных мышах. Девять мышей были распределены по группам, в каждой по три животных. Первой группе мышей был введен конъюгат антигена с КЗ. Второй группе мышей был введен антиген, разведенный дистиллированной водой, в той же концентрации, что и в конъюгате с КЗ. Третья группа мышей была контрольной. Антиген вводился внутрибрюшинно в концентрации 100 мкг на животное, перед введением проводили взвешивание (масса мыши ~20 г). Через неделю все группы мышей были проиммунизированы повторно соответствующими растворами антигена, а еще через 6 дней у них были взяты перитонеальные макрофаги.

В результате проведенных исследований были получены следующие результаты (рис. 9): при введении антигена, конъюгированного с КЗ, наблюдалась наибольшая активность макрофагов, и количество восстановленного формазана составило 0.258±0.03 мкг/мл. Введение мышам не конъюгированного антигена приводит к некоторому снижению макрофагальной активности, которая составила 0.234±0.015 мкг/мл. У контрольной группы активность макрофагов составила 0.153±0.03мкг/мл. Таким образом, КЗ вызывало заметное стимулирование дыхательной активности макрофагов.




Рис. 9. Количество восстановленного формазана в перитонеальных клетках крыс после иммунизации животных антигеном и его конъюгатом с КЗ.

3.6. Мицеллярные системы на основе неионогенных поверхностно активных веществ и их применение в конструирование лекарств

Несмотря на то, что история исследований мицеллярных структур насчитывает около ста лет, их до сих пор принято считать своеобразными объектами физической химии. Интерес к воднодисперсным (и обращенным) мицеллам заметно возрос в последние годы в связи с применением их в качестве носителей разнообразных биологически активных соединений (Nandi, Basumallick, 1993; Armstrong et al., 1993; Aral, Akbuga, 2003) и конструированием на их основе лекарственных препаратов (Логинова, Полозов, 2003).

Оценка возможностей применения системы мицелла-активное вещество в современной ветеринарии и медицине является весьма актуальной задачей. Это связано с перспективами их использования для приготовления инъекционных лекарственных средств, содержащих гидрофобные вещества в качестве активного компонента (Woodburn, Kessel, 1994; Munshi et al., 1997). Однако биологические свойства мицелл мало изучены. В особенности вопросы, связанные с биодинамикой данных систем и их способностью реагировать с клеточными структурами. Исходя их этого, в данной части нашей работы были исследованы эффекты взаимодействия мицелл с различными системами организма лабораторных животных.

Вначале оценивалось воздействие мицеллярных систем на клетки ретикулоэндотелиальной системы. Опыты проводили на 4-5 месячных кроликах породы шиншилла, подобранных по принципу аналогов. Всех животных разделили на четыре группы по три головы в каждой. Препараты вводили внутримышечно в область внутренней поверхности бедра в дозе по 0.1 мл/голову, что соответствовало 20 мг белка. Кроликам первой группы вводили БСА, растворенный в мицеллярной системе (кремофор EL) с добавлением витаминов (А, Е, С), второй группы – БСА, растворенный в мицеллярной системе без витаминов, третьей группы – БСА, эмульгированный в полном адъюванте Фрейда (ПАФ), а для четвертой группы БСА растворяли в физиологическом растворе. Концентрация БСА составляла 200 мг/мл. Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 2 недели. Через 7 дней после второй иммунизации проводилась реиммунизация.

Пробы крови отбирали из ушной вены через неделю после каждой иммунизации. Количество (титр) антител определяли в реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой методике. Ферментативную активность лимфоидных клеток крови (щелочную и кислую фосфатазу) определяли методами Кеплоу и Берстона. Фагоцитарную активность определяли по содержанию катионного белка методом Шубича и МТТ-тестом по Парку.

В результате проведенных исследований установлено, что через неделю после первой иммунизации титр антител в контрольной и опытной группах находился на одном уровне и составлял 1:128 (табл.2).

Таблица 2. Титры антител в сыворотке крови кроликов


Состав раствора для иммунизации

Первая иммунизация

Вторая иммунизация

Реиммунизация

Мицеллы (Е, А, С) + БСА

1:128

1:5120

1:10240

Мицеллы + БСА

1:128

1:2560

1:5120

ПАФ + БСА

1:128

1:2560

1:5120

Физ. р-р + БСА

1:128

1:1280

1:2560

Анализ изменений ферментативной активности клеток лимфоидного ряда кроликов при иммунизации их антигенами, вводимыми с различными адъювантами, показал незначительное увеличение активности кислой и щелочной фосфатазы в лимфоидных клетках, как при введении антигена, растворенного в физиологическом растворе, так и при иммунизации антигеном, растворенным в ПАФ и мицеллярными растворителями (табл. 3).

Полученные результаты оценок ферментативной активности лимфоидных клеток свидетельствуют о способности мицеллярного раствора с витамином Е стимулировать образование антител при иммунизации антигенами, на что указывает повышение активности, как катионных белков клеток нейтрофильного ряда, так и повышенная активность данных клеток в восстановлении зерен формазана при проведении НСТ-теста. ПАФ и водный раствор мицелл в данном случае проявляет аналогичную или даже более низкую реакцию. Что наблюдается так же и при иммунизации антигеном, растворенным в физиологическом растворе (табл. 4).

Таблица 3. Ферментативная активность клеток лимфоидного ряда

Название препарата

1-я иммунизация

2-я иммунизация

реиммунизация

КФ ед.)

ЩФ (ед.)

КФ (ед.)

ЩФ (ед.)

КФ (ед.)

ЩФ (ед.)

Кремофор EL, витамин Е+БСА

263±2

106±1

222±1

157±1.2

220±2

140±1

ПАФ+БСА

271±2

178±1

239±1

160±1

225±2

150±1

Физ.р-р+БСА

250±3

90±1

235±1

161±1

222±2

150±1

Контроль

90±2

100±1

87±1

100±1

90±2

95±1
  1   2   3

Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconВыделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов enterobacter, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 23 биотехнология

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconЗадачи патофизиологии-2 модуля: сформировать знание и понимание патофизиологических механизмов возникновения и развития основных симптомов и синдромов поражения сердечнососудистой системы лекционный комплекс
Ссс в норме и патологии у взрослых и детей различного возраста на основе понимания физиологических процессов, обеспечивающих ее работу...

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconЁм Александрович разработка и доклиническое изучение новых фармацевтических композиций на основе диметилдиглицероксисилана для местного применения 14. 03. 06. фармакология, клиническая фармакология

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconСергей Александрович Нефедов

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconПояснительная записка по подготовке документов для регистрации лекарственных препаратов ветеринарного назначения. Перечень документов, предоставляемых на государственную регистрацию лекарственных препаратов

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconРазработка и применение лекарственных средств на основе ароксиалканкарбоновой кислоты при болезнях животных, вызываемых условно патогенной микрофлорой 16.

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconЦель: На основе изучения важнейших механизмов повреждения при тяжелой комбинированной травме разработать раннюю патогенетическую стратегию лечения. Материалы и методы

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconЗадачи патофизиологии-2 модуля: сформировать понимание патофизиологических механизмов возникновения и развития основных синдромов и патологических состояний мочеполовой системы лекционный комплекс
Задачи патофизиологии-2 модуля: сформировать понимание патофизиологических механизмов возникновения и развития основных синдромов...

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconИзучение острой токсичности препаратов для обезболивания

Староверов сергей Александрович Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных iconСергей Александрович Нефедов
С. А. Нефедова представляет собой настоящий клад – они могут найти здесь много нового и интересного – не только факты, но и концепцию,...

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU