Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации icon

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации





Скачать 149.51 Kb.
НазваниеГосударственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации
Дата конвертации23.05.2013
Размер149.51 Kb.
ТипРеферат
Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование

Российской Федерации





4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


Выявление антител к вирусам гриппа A(H5N1) в сыворотках

людей и животных при естественной инфекции и вакцинальном

процессе в реакции микронейтрализации


Методические рекомендации


Издание официальное


Москва 2009


4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


Выявление антител к вирусам гриппа A(H5N1) в сыворотках

людей и животных при естественной инфекции и вакцинальном

процессе в реакции микронейтрализации


Методические рекомендации


1. Разработаны: ГУ НИИ гриппа РАМН (профессором, д.м.н. А.А. Сомининой, к.б.н. В.З. Кривицкой, аспиранткой Н.В. Третьяковой, Е.В. Сорокиным, Т.Р. Царевой).

2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко «___»________ 2009 г.

3. Введены впервые.


Содержание


1. Область применения …………………………………………………




2. Введение ……………………………………………………




3. Описание метода ………………………………………….. ………….




3.1. Формула метода …………...




3.2. Показания и противопоказания к применению метода …………...




3.3. Материально-техническое обеспечение ……………………..




3.4. Описание метода ………………………………….




4. Эффективность метода …………...









УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы


по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации



Г.Г. Онищенко


«03» 06 2009 года

01/7752-9-34

Дата введения: с момента утверждения



4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


Выявление антител к вирусам гриппа A(H5N1) в сыворотках

людей и животных при естественной инфекции и вакцинальном

процессе в реакции микронейтрализации


Методические рекомендации.


____________________________________________________________________

1.Область применения.



1.1. Метод предназначен для специфического выявления вируснейтрализующих антител в сыворотках людей и животных, формирующихся в результате естественной инфекции или вакцинации. Наибольшую значимость имеет выявление антител к вирусу гриппа А(H5N1), поскольку по чувствительности и специфичности метод превосходит традиционный агглютинационный тест – реакцию торможения гемагглютинации, мало эффективный при выявлении антител к этому возбудителю. Суть метода заключается в заражении клеточной культуры MDCK, выращенной в 96-луночных планшетах, смесями двукратных разведений исследуемой сыворотки с вирусом гриппа А(H5N1), взятым в дозе 100 ТИД50, с последующей инкубацией инфицированных культур в термостате с подачей СО2 в течение 2 суток. При этом сыворотки, содержащие антитела, нейтрализуют вирус и препятствуют его размножению в клеточной культуре, тогда как в отсутствие антител вирус активно размножается, что определяется количественно при проведении иммуноферментного анализа непосредственно на фиксированном монослое. За титр антител принимается последнее разведение сыворотки, при котором отмечается отчетливая ингибиция вирусной репродукции, определяемая по соответствующей формуле.

1.2. При подготовке настоящих МР были использованы инструкции, полученные из Influenza Division, Cеntres for Disease Control and Prevention (Atlanta, USA), предназначенные, однако, для определения антител к современным возбудителям гриппозных эпидемий – вирусам гриппа A(H1N1), A(Н3N2) и В, которые были модифицированы в ЛБ применительно к задачам выявления антител к вирусам гриппа птиц – вероятным возбудителям предстоящей пандемии, а также в целях повышения чувствительности теста, безопасности работ и воспроизводимости получаемых результатов. В работе использовали вакцинный вирус гриппа A(H5N1), штамм NIBRG-14, полученный методом обратной генетики в лаборатории д-ра J. Wood (National Institute for Biological Standardization and Control, United Kingdom), за что авторы выражают свою благодарность.


2. Введение

Вирусы гриппа А(H5N1) все шире распространяются по планете с формированием эндемичных очагов в ряде районов мира, откуда он периодически разносится перелетными птицами в определенных направлениях, вызывая опустошительные эпизоотии. К настоящему времени в процесс уже было вовлечено более 50 стран мира, включая Россию.

В странах Юго-Восточной Азии, Южной Европы и Африки, по данным ВОЗ, по состоянию на 8 декабря 2008 г. среди людей зарегистрировано 387 случаев тяжелых респираторных заболеваний, вызванных вирусом гриппа А(H5N1) протекающих с явлениями нарастающего дистресс-синдрома, диареи и мультиорганных поражений, развивающихся, как правило, на фоне «цитокинового шторма», и закончившихся для 245 больных летальным исходом.

В анамнезе заболевших обычно регистрируются контакты с пораженной вирусом гриппа A(H5N1) птицей, но в некоторых случаях выявить источник заражения так и не удалось. Это определяет необходимость проведения расширенных серологических исследований в целях регистрации факта и установления цепи передачи инфекции от человека к человеку. Кроме того, рекомендуется проводить серологическое обследование лиц, задействованных в процесс уничтожения пораженного вирусом поголовья птиц.

С точки зрения подготовки к возможной пандемии существенную важность представляет расширение исследований по разработке и обновлению гриппозных вакцин A(H5N1) для людей, а также по обновлению «банка» соответствующих резервных штаммов, отличных в антигеном отношении от уже имеющихся штаммов (в связи с появлением все новых генетических кластеров возбудителя).

В целом, это привело к пониманию необходимости разработки чувствительных и специфичных тестов, которые были бы способны наиболее точно отражать защитную роль сформировавшегося после вакцинации гуморального иммунитета по отношению к новым дрейф-вариантам вируса.

Традиционные агглютинационные тесты, широко используемые при оценке иммуногенности «сезонных» гриппозных вакцин, такие как РТГА, оказались слабо чувствительными и плохо поддающимися стандартизации при выявлении антител к вирусам гриппа A(H5N1). Результаты реакции, как оказалось, зависят не только от вида эритроцитов (лошади, индюки, гуси), но и от выбора особи донора, что не позволяет получать результаты, сопоставимые в разных лабораториях.

Использование реакции нейтрализации вируса специфическими антителами с определением их конечных титров дает наиболее точное представление о защитных свойствах гуморального иммунитета. Применение современных микропланшетных технологий с учетом результатов ингибиции вирусной репродукции антителами в ИФА позволяет дать количественную оценку содержания антител и их нейтрализующего действия в отношении вновь появляющихся вирусов Н5, что, в конечном счете, дает основание для выбора оптимальной штаммовой композиции вакцин. По современным представлениям (Nolan Т.М. et al., 2008; Ehrlich H.J. et al., 2008) МН получила всеобщее признание и является обязательным тестом при оценке иммуногенности новых Н5-вакцин.


3. Описание метода


3.1. Формула метода


В основу разработанного варианта реакции микронейтрализации (МН-ИФА) в отличие от ранее описанных положено:


  • использование апатогенного вакцинного штамма вируса гриппа A(H5N1), полученного методом обратной генетики, что позволяет проводить определение антител в условиях, разрешенных для работы с возбудителями III группы патогенности

  • количественный учёт результатов реакции в ИФА

  • применение моноклональных антител к консервативным сайтам в составе молекулы NP вируса гриппа А, разработанных в ГУ НИИ гриппа

  • использование не канцерогенного субстрата - 3,3’ 5,5’ тетраметилбензидина при учёте результатов МН-ИФА, что обеспечивает безвредность проведения анализа.


3.2. Показания и противопоказания к применению метода


Показания к применению метода:

  • обследований лиц из групп высокого риска инфицирования вирусом гриппа A(H5N1), а также больных с тяжелыми формами респираторных инфекций и контактных лиц,

  • изучение иммуногенности гриппозных вакцин из вируса A(H5N1).

Противопоказания:

  • – отсутствие условий для работы с возбудителями третьей группы патогенности


3.3. Материально-техническое обеспечение


3.3.1. Материалы


  • Перевиваемая культура клеток MDCK,

  • Планшеты для работы с культурами клеток, плоскодонные, 96-луночные («Nunc» или «Sarstedt»),

  • Чашки Петри, одноразовые, стерильные,

  • Пробирки с пробками, объемом до 5 мл, стерильные, одноразовые (для разведения сывороток и вируса),

  • Пробирки с пробками, объемом до 2 мл, стерильные, одноразовые (для приготовления ТPCК-трипсина).


Растворы, среды и реактивы:


  • Среда Игла, стерильная

  • Фосфатно-солевой буфер, рН 7,2-7,4, стерильный

  • Трипсин ТPCК, «Sigma», Кат. № T1426, стерильный

  • Пероксидазный конъюгат моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа типа А

  • 3,3´, 5, 5´ тетраметилбензидин, «Sigma», Кат. № T2885

  • Ацетон

  • Перекись водорода

  • Серная кислота

  • Диметилсульфоксид (для приготовления концентрированного раствора тетраметилбензидина)

  • Сухое молоко


3.3.2. Оборудование


  • Ламинарный бокс 2 класса защиты,

  • Инкубатор (36 ± 0,5)С с регулируемой подачей СО2 (5-6%),

  • Термостат (37º С),

  • Мультискан для учета результатов ИФА, фильтр - 450 нм (пик поглощения тетраметилбензидина),

  • Инвертированный микроскоп,

  • Центрифуга до 6 тыс. об/мин,

  • Автоматическая пипетка со сменным объемом 100-1000 мкл, одноканальная,

  • Автоматическая пипетка со сменным объемом 20-200 мкл, одноканальная,

  • Автоматическая пипетка со сменным объемом 2-20 мкл, одноканальная,

  • Автоматическая пипетка со сменным объемом 50-300 мкл, восьмиканальная,

  • Наконечники к пипеткам, одноразовые, стерильные,

  • Рефрижератор с морозильной камерой,

  • Водяная баня с регуляцией температуры нагрева (56º С).


3.4. Описание метода


Стадия 1. Определение инфекционной активности вируса гриппа A(H5N1) в клеточной культуре MDCK.


Клеточную культуру MDCK в концентрации 200 тысяч клеток / мл засевают в 96 –луночные культуральные планшеты и выращивают в течение 1-2 суток до 75% -95% состояния монослоя в СО2- инкубаторе при температуре (36 ± 0,5)С. Не допускают перерастания и старения культуры. Перед постановкой опыта титрования вируса клетки отмывают 2 раза средой Игла без сыворотки, после чего во все лунки планшета вносят по 100 мкл среды Игла, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 2 мкг/ мл.

Готовят 10-кратные разведения вируса на среде Игла без сыворотки, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 2 мкг в мл, в ряду из 6 пробирок, содержащих по 450 мкл среды с TPCK-трипсином каждая. Вирус вносят в первую пробирку в объеме 50 мкл и после тщательного перемешивания, меняя каждый раз наконечники, переносят по 50 мкл в следующие пробирки.

Подготовленные разведения вируса, начиная с последнего, вносят по 50 мкл в 4 ряда лунок культурального планшета с монослоем клеток MDCK.

Для контроля состояния клеточной культуры (КК) в 4 лунки планшета вносят по 50 мкл среды Игла, содержащей TPCK-трипсин (2 мкг/ мл).

Планшеты помещают в СО2 инкубатор с температурой (36 ± 0,5)С.

Титр вируса оценивают в ИФА через 48ч. С этой целью культуральную жидкость из всех лунок удаляют, клетки дважды отмывают фосфатно-солевым буфером, рН 7,2-7,4 (ФСБ) и фиксируют 80% холодным ацетоном (15 -20 мин при 0С). После фиксации в лунки вносят по 200 мкл 5% обезжиренного молока в ФСБ (ФСБ-М)* для блокировки свободных мест на планшете. После часовой инкубации при температуре 37С молоко удаляют и в лунки вносят по 100 мкл пероксидазного конъюгата моноклональных антител 4Н1 к NP вируса гриппа А, разведенного 1/4000 на ФСБ-М. После часовой инкубации при 37С и 4-х кратного отмывания ФСБ пероксидазную реакцию проявляют добавлением в каждую лунку по 100 мкл субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% Н2О2 в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0*. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. После остановки реакции (добавлением в каждую лунку по 50 мкл 2N H2SO4) оптическую плотность измеряют спектрофотометрически при длине волны 450 нм (ОП450).

За титр вируса принимают его последнее разведение, при котором значения ОП450 в 2 раза превышают значения КК.

Вычисляют титр вируса по методу Reed and Muench.

Определяют разведение вируса, при котором в 50 мкл будет содержаться 100 ТЦД50 вируса по данным ИФА.


_________________________________________________________________________

*Примечание.

Рабочий раствор ТМБ готовят из концентрата, который можно длительно хранить в замороженном состоянии. Концентрат готовят следующим образом: 10 мг ТМБ растворяют в 2 мл диметилсульфоксида, раствор разливают по 0,2 мл в криопробирки и хранят при температуре -20ºС. Перед проведением заключительной стадии ИФА нужное количество концентрата размораживают, разводят ацетат-цитратным буфером ( рН 5,0) в 50 раз (до конечной концентрации 0,1 мг/мл), непосредственно перед употреблением добавляют перекись водорода до концентрации 0,02%, после чего рабочий раствор используют в качестве субстратной смеси для проявления пероксидазной реакции.

Приготовление 5% обезжиренного молока.

К навеске порошка сухого молока весом 5 г добавляют 100 мл ФСБ, смесь тщательно размешивают, после чего центрифугируют в течение 1 часа при 5 000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают и фильтруют через марлевый тампон, вложенный в воронку (для удаления жира с поверхности молока) и используют для ИФА. Раствор молока готовят не ранее, чем за день до постановки опыта, хранят при 4 ºС, не замораживают.


Стадия 2. Постановка реакции нейтрализации (РН).


Клеточную культуру MDCK в концентрации 200 тысяч клеток / мл засевают в 96 –луночные культуральные планшеты фирмы Nunc или Sarstedt и выращивают в течение 1-2 суток до 75% -95% состояния монослоя в СО2- инкубаторе при температуре (36 ± 0,5)С. Перед постановкой опыта клетки отмывают 2 раза средой Игла без сыворотки, после чего в лунки планшета вносят по 50 мкл среды Игла, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 2 мкг/ мл.

Исследуемые сыворотки, взятые в объеме 50 мкл, разводят в 10 раз средой Игла без трипсина и прогревают при 56С в течение 30 минут.


Каждую пробу сыворотки разводят в круглодонных планшетах в двух параллельных рядах. В первые лунки ряда А вносят по 120 мкл прогретых сывороток из расчета по две лунки на каждую сыворотку (разведение 1/10). В остальные ряды вносят по 60 мкл среды Игла. Далее готовят последовательные 2-кратные разведения прогретых сывороток в объеме 60 мкл в вертикальных рядах планшета (от 1/20 до 1/1280). Из последнего разведения 60 мкл сыворотки удаляют.

Рабочее разведение вируса (РРВ), содержащего 100 ТЦД50/50 мкл, готовят на среде Игла, содержащей TPCK-трипсин в концентрации 4 мкг в мл. В каждую из лунок планшета с разведенными сыворотками вносят по 60 мкл РРВ. Пробы осторожно перемешивают круговыми движениями планшета по столу, следя за тем, чтобы не было их разбрызгивания. Смеси инкубируют в течение 2 часов при (36 ± 0,5)С в СО2-инкубаторе, после чего их вносят по 100 мкл в лунки подготовленных планшет с отмытым монослоем клеток MDCK, содержащих по 50 мкл среды Игла с TPCK-трипсином (2 мкг/ мл). Внесение начинают со смесей, содержащих наименьшее разведение сыворотки (1/10). Исследование каждой сыворотки дублируют.

Два ряда лунок в каждом планшете оставляют для внесения контрольных проб.


В каждом планшете проставляют три контрольные пробы:

  1. Контроль состояния клеточной культуры (КК) - в 2 лунки с монослоем клеток вносят 150 мкл среды Игла с TPCK-трипсином (2 мкг в мл) без вируса;

  2. Контроль дозы вируса (КДВ). Определяют путем повторного титрования РРВ, взятого в исходном состоянии и в разведениях 10 –1, 10-2, 10-3. Разведения РРВ вносят по 50 мкл в 2 ряда лунок с добавлением 100 мкл среды Игла с TPCK-трипсином (2 мкг в мл).

  3. Контроль РРВ. РРВ вносят в неразведенном виде в 3 лунки с клетками MDCK.

  4. Контроль сыворотки (КС). Каждую из тестируемых сывороток в разведении 1/10 (50 мкл) вносят в 1 лунку с монослоем клеток с добавлением 100 мкл среды Игла (без вируса).


Планшеты инкубируют в СО2 инкубаторе при температуре (36 ± 0,5)С в течение 48ч. По окончании инкубации среду полностью удаляют, монослой фиксируют холодным 80% ацетоном в течение 15-20 мин, после чего проводят ИФА, как описано на стадии 1.


Стадия 3. Учет результатов


Нейтрализующим титром сыворотки считают ее последнее разведение, при котором показатель ОП450 ниже порогового показателя (ПП), определенного по формуле:


ПП = ОП450 РРВ - ОП450 КК + ОП450 КК , где

2


ОП450 РРВ – среднее значение ОП450 в контрольных лунках, содержа-

щих рабочее разведение вируса,

ОП450 КК - среднее значение ОП450 в контрольных лунках с незара-

женной клеточной культурой


Диагностически достоверным считают четырехкратное и более увеличение титров антител в сыворотке реконвалесцента при сравнении с сывороткой, полученной в острой фазе заболевания.


Примечание:

Анализ контрольных показателей

1.КК

Клеточный монослой в контрольных лунках должен быть сохранен полностью. Показания ОП450 КК не должны превышать 0,2, различия между контрольными лунками не должны быть более 15%.

2.РРВ

Значения ОП450 РРВ не должны быть ниже 1,0.

3.КДВ

При правильном определении дозы вируса позитивный сигнал, превышающий в 2 раза КК, должен регистрироваться в лунках с клетками, инфицированными вирусом в РРВ 10 –1 и 10 – 2 и отсутствовать в разведении 10 – 3. В случае, если при контроле дозы вируса оказывается, что она не соответствует 100 ТЦД50, опыт повторяют.

4.КС

Показания в лунках с КС не должны отличаться от КК более чем на 10%.


При подозрении на заболевание у людей оптимальным является одновременное исследование парных сывороток, взятых в острый период заболевания и не ранее 14-ого дня после начала заболевания.

С учетом Рекомендаций ВОЗ (2007) и имеющихся ретроспективных эпидемиологических данных (контакт с больными людьми или животными) заболевание гриппом А(Н5N1) считается лабораторно установленным в следующих случаях:

- 4-х кратный и более прирост титра антител к вирусу гриппа А(Н5N1) во второй сыворотке (титр не ниже 1:80), взятой на стадии реконвалесценции, по отношению к первой, взятой в острой стадии заболевания;

- титр антител 1:80 и выше при исследовании одиночной сыворотки, взятой не ранее 14 суток от начала заболевания.


4. Эффективность метода


Предложенный вариант постановки реакции МН для детекции антител к вирусу гриппа А(Н5N1) по сравнению с вариантами, предложенными зарубежными исследователями, позволяет сократить сроки проведения, упростить и сделать более безопасной процедуру анализа.

Сокращение длительности анализа достигается прямой детекцией внутриклеточных вирусных антигенов за счет использования пероксидазного конъюгата моноклональных антител (МКА) 4Н1 к консервативному сайту в составе нуклеопротеина вируса гриппа А, общему для вирусов гриппа человека и птиц, что полностью исключает необходимость проведения второго этапа ИФА - внесения конъюгата антител к IgG мыши.

Важным усовершенствованием реакции является использование вакцинного штамма вируса гриппа А(Н5N1), что позволяет проводить исследование сывороток в условиях работы с вирусами, отнесенными к третьей группе патогенности.

Безопасность проведения иммуноферментного анализа этапе внесения субстратной смеси (для оценки результатов реакции) повышается за счет введения неканцерогенного реактива 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина вместо рекомендованного ранее канцерогенного ортофенилендиамина.

Применение МН при оценке иммуногенности инактивированной Н5-вакцины, привитой волонтерам, показало большую чувствительность и специфичность метода по сравнению с РТГА, мало чувствительной при детекции антител к вирусам гриппа А(Н5N1).

Показатели средних геометрических титров антител после вакцинации, определенные в реакции МН, были на 16 - 29% выше (в зависимости от состава вакцины), чем по результатам наиболее чувствительного варианта РТГА с использованием лошадиных эритроцитов. Частота выявления сероконверсий и количества сывороток с защитным титром антител (1:40 и выше) также была выше в МН, чем в РТГА (на 11-20% и 9%, соответственно).

Специфичность реакции, оцененная при исследовании сывороток волонтеров, взятых до вакцинации, также была выше в МН, чем в РТГА.


Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconГосударственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconГосударственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации Государственные санитарно-эпидемиологические правила и гигиенические нормативы

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconГосударственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика и профилактика ротавирусной инфекции методические указания му 1 2957-11 Москва – 2011

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconГосударственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Государственные санитарно-эпидемиологические правила и гигиенические нормативы

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconФедеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека главный государственный санитарный врач российской федерации постановление от 28 января 2008 г. N 4 Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил сп 2322-08
Об утверждении Положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном...

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconГлавный государственный санитарный врач российской федерации постановление
Положения о государственном санитарно эпидемиологическом нормировании, утвержденного Постановлением Правительства Российской Федерации...

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconОрганизация санитарно-эпидемиологической службы Вопрос N: 1 Санитарно-эпидемиологическое благополучие населения обеспечивается

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconПравительство российской федерации постановление
В целях эффективного осуществления государственного ветеринарного надзора по охране территории Российской Федерации от заноса заразных...

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconКраткий отчет о результатах научно-исследовательской деятельности
Российской Федерации, разработки и изготовления продукции, находящейся в сфере интересов Российской Федерации и обеспечивающей безопасность...

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации iconГосударственная система санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU