Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы icon

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы





Скачать 359.02 Kb.
НазваниеМониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы
Кудрявцев Виталий Андреевич
Дата конвертации31.05.2013
Размер359.02 Kb.
ТипАвтореферат

На правах рукописи




Кудрявцев Виталий Андреевич




Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы.


Специальность

06.02.01 - Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук




Научный руководитель

доктор биологических наук,

профессор, заслуженный

деятель науки РФ

А.И. Жигачев


Санкт-Петербург – 2007

Работа выполнена в проблемной лаборатории кафедры ветеринарной генетики и животноводства Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.



Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Жигачев Анатолий Иванович (СПбГАВМ)


Официальные оппоненты:


Доктор биологических наук, профессор Паронян Иван Амоякович

(ГНУ ВНИИГРЖ)


Доктор сельскохозяйственных наук, заслуженный деятель науки КАССР, заслуженный деятель науки РФ, профессор Болгов Анатолий Ефремович (ФГОУ Петрозаводский государственный университет).


Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства (ГНУ ВНИИЖ)


Защита состоится «25» апреля 2007 года в часов на заседании диссертационного совета Д. 220.060.02 при Санкт-Петербургском государственном аграрном университете по адресу: 196601, Санкт-Петербург – Пушкин, Петербургское шоссе, дом 2, ауд. 342


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного аграрного университета.


Автореферат разослан «23» марта 2007 года.


Ученый секретарь диссертационного Совета, профессор Павлов Г.Л.


Общая характеристика

Актуальность работы

Процесс эволюции животных сопровождается мутациями. Некоторые из них подхватываются отбором и со временем входят в комплекс отличительных признаков породы. Именно эти мутации в интегрированном действии с комбинативной вариабельностью и являются источником для образования в эволюции и в селекции новых форм животных (Л.К. Эрнст, 1995). Значительная часть мутаций, не прошедших через «горлышко эволюции», формирует генетический груз популяций в той или иной степени снижающий уровень воспроизводства стад, жизнеспособность, резистентность, адаптационные и продуктивные качества животных. В условиях крупномасштабной селекции, главным звеньями которой являются искусственное осеменение, трансплантация эмбрионов, а также клеточная и генная инженерия, возникает опасность интродукции вредных мутаций в нижеследующие поколения внутри породы и между родственными и неродственными породами. Генетическая эрозия, влекущая за собой снижение генофонда пород и неизбежное повышение уровня гомозиготности популяций, в ближайшее время может стать одним из факторов массового проявления уродств и аномалий в стадах (Марзанов Н., Амерханов Х., 2001). Проблемы генетической безопасности использования племенного материала в условиях глобализации животноводства становятся актуальными и практически значимыми, особенно в свете последних экспериментальных данных о распространении летальных генов в голштинской породе крупного рогатого скота (Жигачев А.И., 2004). У этого вида животных согласно сводке Dolling C., J. Lauvergne, К. Huston, P. Millar, 2000 на разных породах и в разных странах изучено свыше 400 аномалий разных органов и систем, в отношении большей части которых установлен аутосомный рецессивный тип наследования. Анализ многочисленных источников свидетельствует о породной специфичности скрытого груза генных и хромосомных мутаций, связанной с эффектом основателя, миграциями, что вызывает необходимость обоснования и разработки новых принципов селекции, системы мониторинга, включая вопросы совершенствования методов оценки быков-производителей, сертификации племенного материала, особенно при импорте (Эрнст Л.К., Жигачев А.И. 2006; Фисинин В.И., 2006).

Цель и задачи исследований


В связи с массовым проявлением уродств у телят в сельхозартели «Шугозеро» Тихвинского района Ленинградской области, перед нами была поставлена цель – изучить роль наследственности и тип наследования этих аномалий, провести анализ факторов, приведших к их распространению, и разработать принципы мониторинга генетического груза в селекции крупного рогатого скота айрширской породы.

Задачи исследований:

  • изучить и систематизировать спектр уродств и врожденных аномалий у телят в хозяйстве;

  • определить частоту уродств и аномалий, абортов и мертворождений в приплоде;

  • провести анализ продолжительности утробного развития в случаях перинатальной смертности приплода;

  • изучить соотношение полов среди нормального и аномального приплода;

  • провести анализ генеалогии стада, родословных аномальных животных;

  • установить наличие аналогичных уродств и аномалий у животных айрширской породы в других хозяйствах, выявить родственные связи между ними;

  • провести анализ типа наследования аномалий;

  • изучить факторы, способствующие распространению аномалий в айрширской породе;

  • составить перечень генетических болезней в айрширской породе;

  • разработать принципы мониторинга генетических болезней в айрширской породе.

Научная новизна


Впервые получены данные о спектре уродств у телят при массовом характере их проявления в товарном хозяйстве по разведению айрширской породы, связанные с использованием одного быка в системе крупномасштабной селекции. Представлены результаты генетического анализа, свидетельствующие о наследственном характере этиологии этих аномалий.

Теоретическая и практическая значимость работы


Изучены причины распространения мутаций в породах крупного рогатого скота. Показана роль интродукции мутантных генов, их дрейфа из одной популяции породы в другие при отсутствии системы контроля и превентивной ветеринарной селекции. Рассматриваются молекулярно-генетические механизмы гетероморфности и разной экспрессивности аномалий.

Апробация работы


Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов СПбГАВМ (2004-2006 г.г.), Международной конференции по патологической физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на Международной конференции посвященной Витебской ветеринарной академии (Витебск, 2004).

Структура и объем работы


Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 30 таблиц, 20 рисунков. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методика, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, предложения. Список литературы включает 204 источника, в том числе 157 на иностранных языках.

Основные положения, выносимые на защиту:


  • высокая частота уродств в одном хозяйстве у телят – потомков одного быка;

  • классификация аномалий, широкий спектр их проявления, гетероморфность, разная экспрессивность;

  • результаты генетического анализа, свидетельствующие о наследственном характере распространения уродств;

  • гипотеза о доминантном типе наследования уродств в популяции айрширского скота;

  • структура генетического груза в айрширской породе;

  • принципы мониторинга интродукции вредных мутаций в айрширской породе.

Материал и методика исследований

Основная работа проведена по материалам учета воспроизводства крупного рогатого скота айрширской породы в сельскохозяйственной артели (СА) «Шугозеро» Тихвинского района Ленинградской области, где в 2001-2002 г.г. имело место массовое проявление уродств у телят. Также использовали материалы зоотехнического и ветеринарного учета по аналогичным уродствам у телят в других хозяйствах Тихвинского, Лодейно-польского, Волховского, Бокситогорского районов Ленинградской области. Для выяснения этиологии уродств у телят нами была разработана методика исследований, которая предусматривала изучение целого ряда вопросов:

  1. Анализ показателей воспроизводства стада.

  2. Анализ спектра и частота уродств у телят.

  3. Особенности кормления крупного рогатого скота.

  4. Анализ экологической ситуации в хозяйстве (уровень радиации, концентрация тяжелых металлов).

  5. Анализ эпизоотической обстановки.

  6. Генетический анализ.

Данные для анализа по отдельным вопросам ветеринарного характера нам представила ветеринарная станция Тихвинского района. Основное внимание было сосредоточено на детальном изучении роли наследственности в этиологии уродств и аномалий у телят в хозяйстве. При этом мы пользовались материалами первичного зооветеринарного учета, журналов осеменений и отелов, регистрации приплода, родословными коров, закрепляемых быков, фотодокументами, иллюстрирующими разные типы уродств у телят. При проведении генетического анализа, с целью установления роли наследственности и типа наследования уродств у телят, пользовались общепринятой методикой, изложенной в трудах О.А. Ивановой, 1966, 1972; Ф.Б. Хатта, 1969; Э. Визнера и З. Виллера, 1979; В.Л. Петухова, А.И. Жигачева, Г.А. Назаровой, 1985, 1996; Л.К. Эрнста, А.И. Жигачева, 1990, Б. Вейра, 1995. В работе использовали клинико-генеалогический, популяционно-генетический, сегрегационный методы анализа. Сущность клинико-генеалогического анализа в наших исследованиях заключалась в следующем. Все новорожденные телята подвергались тщательному визуальному осмотру, на основе которого проводилась запись о наличии уродств и аномалий и описание их клинической картины. В отдельных случаях более детальные исследования проводились на кафедре патологической анатомии СПбГАВМ. На основе этих данных был изучен спектр уродств и аномалий у телят и клинически выраженная гетерозиготность, что позволило установить различия в их экспрессивности. Одновременно с анализом патолого-анатомического проявления уродств изучили генеалогию телят-уродов. Анализ родословных – генеалогический метод – дал возможность определить роль наследственности и тип наследования аномалий. При этом вопрос об «отцовстве» телят-уродов фактически не стоял, так как в хозяйстве находилось семя одного быка – Воспитателя 767, которое затем было заменено на семя другого производителя. Но для того, чтобы еще раз убедиться в пагубном влиянии именно его генотипа на жизнеспособность потомства, были запланированы и реализованы проверочные спаривания. Применение популяционно-генетического метода предусматривало анализ данных литературы о спектре груза генных мутаций в породах крупного рогатого скота, в разных популяциях и субпопуляциях айрширской породы стран Европы, Америки и других континентов. Этот метод использовался для анализа интродукции вредных мутаций при миграции (перемещении) племенного материала как важнейшего звена крупномасштабной селекции. Сегрегационный метод анализа предусматривал анализ результатов скрещиваний для определения типа наследования признаков. В наших экспериментах планировалось изучить результаты предыдущих (до закрепления быка Воспитателя 767) подборов быков и последующих подборов (после снятия с воспроизводства быка Воспитателя 767). При этом изучали наличие или отсутствие уродств и аномалий у потомства, их частоту, соотношение полов в приплоде, наличие родственных связей родительских пар. Отдельно были запланированы проверочные (повторные) спаривания отобранной группы коров, давших за предыдущий отел уродливого теленка от быка Воспитателя 767 с этим же производителем. При определении типа наследования аномалий исходили из общепринятых постулатов:

  • Родители аномальных животных, как правило, имеют родственные отношения, замыкающиеся на одного или нескольких предков (при рецессивном наследовании).

  • Уродства с равной частотой встречаются у особей мужского и женского пола или только у особей мужского пола (при сцепленном с полом наследовании).

  • Моногенный тип наследования принимали в том случае, если сегрегация – разделение или соотношение нормальных и аномальных фенотипов соответствует известным правилам Менделя (при допущениях определенных частот гетерозигот в маточной части популяции).

  • Если родители аномальных животных не имеют родства между собой, но у них один и тот же отец или предок с отцовской или материнской стороны, то за основу принимается доминантный тип наследования.

  • Полигенное наследование аномалий отличается тем, что ее проявление и частота встречаемости носит семейный характер, когда ее носители и их родители - животные определенной линии или родственной группы.

Статистические данные подвергались биометрическому анализу.

Результаты собственных исследований

Показатели воспроизводства стада и частота уродств у телят айрширской породы в СА «Шугозеро». Сельскохозяйственная артель «Шугозеро» Тихвинского района Ленинградской области занимается производством молока и осуществляет воспроизводство поголовья крупного рогатого скота айрширской породы. По данным зоотехнического учета на 22.11.2001 г. в хозяйстве насчитывалось 1938 голов крупного рогатого скота, в том числе 882 коровы и 172 нетели. До 2001 года воспроизводство молодняка в хозяйстве было стабильным. Так за 1998-2000 г.г. при стабильном поголовье, у коров число абортов составляло 24-31, у нетелей – 3-10; мертворожденных от коров – 10-14, от нетелей – 3-10. Однако, в 2001-2002 годах показатели воспроизводства резко ухудшились. Так за период с января 2001 года по июль 2002 года общая численность приплода составила 624 головы и живыми родился 451 теленок. Из этого числа на данный период 92 (14,7%) имели уродства, 141 теленок (22,6%) оказались нежизнеспособными, остались живыми 244 теленка (39%); мертворожденных было 59 голов (9,2%), все они имели уродства, абортусов 114 (18%). Часть абортированных плодов также имели признаки уродств. Как видно в хозяйстве отмечен чрезвычайно высокий процент уродств среди приплода крупного рогатого скота.

Общая зоотехническая и ветеринарная характеристика хозяйства

В 2001 году СА «Шугозеро» успешно провело заготовку кормов. Рацион питания коров в ноябре 2001 г. включал 30 кг силоса и сенажа, 2,5 кг сена, 1 кг отрубей, 1 кг плющеного зерна, 300 г комбикорма на кг удоя, 1 кг свекловичного жома, 1 кг патоки, соль и мел. В хозяйстве выделены группы коров по контролю за качеством обмена веществ. Биохимические исследования крови от контрольных групп коров показали, что отклонений в качестве обмена крови нет. Упитанность животных в хозяйстве средняя и выше средней. Удой на 1 корову составил на 01.11.2002 г. 2786 кг. Хозяйство благополучно по острозаразным заболеваниям. Проводятся оздоровительные мероприятия по лейкозу крупного рогатого скота. На 01.11.2001 г. в хозяйстве выявлено 1,0% коров – носителей вируса лейкоза, у телок 6 месяцев – 2,3% носителей ВЛКРС. Телки 12-18 месяцев, нетели – свободны от ВЛКРС. В хозяйстве в осенне-летний период проведена дезинфекция животноводческих помещений, качество дезинфекции хорошее. Проведена санация сосудов Дьюара. Проводится плановая вакцинация поголовья крупного рогатого скота против инфекционного ринотрахеита, лептоспироза, колибактериоза, стригущего лишая.

Экологическая ситуация в хозяйстве

Учитывая, что уродства у животных могут быть вызваны действием факторов внешней среды (повышенная радиация, высокая концентрация солей тяжелых металлов, инфекции, дефицит отдельных элементов питания и т.д.), был проведен анализ основных из них.

Уровень радиации

С целью исключения этого фактора в возникновении уродств осуществлена проверка уровня радиационной безопасности СА «Шугозеро». При этом получены следующие показатели:

  1. Территория возле фермы Макарьино – уровень гамма-излучения 13 мкр/ч.

  2. На ферме Макарьино двор № 1 – 15 мкр/ч, родильное отделение – 15 мкр/ч.

  3. Силос в количестве 5 тонн на тракторном прицепе – уровень излучения 15 мкр/ч.

  4. Комплекс Палуя – территория возле комплекса – 14 мкр/ч, двор № 1 – 17 мкр/ч, двор № 2 – 16 мкр/ч.

  5. Территория возле конторы СА «Шугозеро» – 14 мкр/ч.

Таким образом, по результатам радиологического исследования уровень гамма-излучения не превысил фона естественного излучения.

Концентрация тяжелых металлов

Для анализа были взяты образцы шерсти от коров, родивших телят-уродов, мертвых телят, абортировавших и давших нормальный приплод и от телят с аномалиями. Исследования проведены в Новосибирском ГАУ. Результаты анализа приведены в таблицах 4-8. Каких-либо однозначных выводов о различиях в концентрации Zn, Cu, Pb, Cd в разных группах животных не представляется возможным. В целом полученные данные не выходят за границы допустимых ПДК. Такие же выводы сделаны на основании экспертизы 16 проб шерсти объединенных в общую пробу в Ленинградской межзональной лаборатории, где концентрация меди составила – 5,54 мг/кг, цинка – 78,32 мг/кг, свинца – 0,058 мг/кг, кадмия – 0,006 мг/кг. Аналогичные данные получены по кормам и молоку.

Химико-токсикологические исследования

Проведен анализ силоса, соломы и сена. Концентрация нитратов в силосе составила 91,2 мг/кг, в соломе – 30,2 мг/кг, в сене – 61,6 мг/кг. Нитраты в исследованных кормах не обнаружены. Содержание радионуклида цезия 137 менее 20 Бл/кг, что не превышает КУ-94. Таким образом, образцы кормов по проверенным показателям были не токсичными и разрешены для использования в корм животных.

Санитарно-микологическое исследование

На анализ были взяты две пробы сена с двух ферм (комплекс Палуя и Макарьино). В первой и второй пробах выделены грибы Alternaria, Mucor – по кожной пробе оба образца корма были нетоксичными и пригодными для фуражных целей. Аналогичные результаты получены при исследовании комбикорма. При химико-токсикологических исследованиях в комбикорме содержание нитратов в первом образце было 97,7 мг/кг, во втором – 218,8 мг/кг. Нитриты, фтор, ионы калия, хлор и фосфорорганические пестициды, амбарные вредители, ферромагнитные примеси не обнаружены. Концентрация NaCl в первой пробе – 0,64%, во второй – 0,76%. Кислотность – 4о. Содержание цезия 137 не превышало КУ-94. На основании этих анализов комбикорм признан нетоксичным и разрешен для фуражных целей. При гаммоспектрометрическом исследовании одной сборной пробы шерсти удельное содержание радионуклидов цезия 137 составило 28,1 Бл/кг, что находится в пределах допустимых норм. Такие же выводы сделаны при исследовании 16 проб кормов на содержание радионуклидов Cs 137 и Sr 90.

Спектр уродств и их классификация у телят айрширской породы

Из предыдущего раздела следует, что в СА «Шугозеро» за короткий период времени отмечен чрезвычайно высокий процент уродств у телят. На основании обследования телят-уродов установлена гетероморфность фенотипической картины основных признаков аномалий. Среди телят-уродов были особи с укорочением и отсутствием нижней челюсти, укорочением верхней челюсти, волчьей пастью, дефектами осевого и периферического скелета, помутнением роговицы глаз и другими. Аномалии выявлялись у новорожденных телят, как при нормальном сроке утробного развития, так и у абортусов и выкидышей. Среди них были особи с массой от 10-15 кг (карликовость) до 80 кг и выше (гигантизм). Обобщенные данные по спектру уродств у телят представлены в таблице 1.

Таблица 1. Систематизация уродств у телят айрширской породы в сельхозартели «Шугозеро» по нозологическим признакам.



п/п

Нозологические признаки уродств

Количество

животных с аномалией

В % %

От общего числа уродств

1

Укорочение нижней челюсти

8

7.68

2

Укорочение нижней челюсти, дефекты осевого и периферического скелета

7

6.72

3

Укорочение нижней челюсти, дефекты конечностей (периферического скелета)

1

0.96

4

Укорочение нижней челюсти, дефекты осевого скелета

1

0.96

5

Укорочение нижней челюсти, «баранья голова»

1

0.96

6

Укорочение нижней челюсти, помутнение роговицы глаз

4

3.84

7

Укорочение нижней челюсти, помутнение роговицы глаз, «лосевидность»

1

0.96

8

Укорочение нижней челюсти, помутнение роговицы глаз, «лосевидность», «щучья голова»

1

0.96

9

Укорочение нижней челюсти, «лосевидность», «щучья голова»

2

1.92

10

Сильная редукция нижней челюсти и дефекты конечностей

2

1.92

11

Сильная редукция нижней челюсти, «волчья пасть», артрогрипоз передних и задних конечностей

1

0.96

12

Сильная редукция нижней челюсти у плода, «щучья голова»

1

0.96

13

Отсутствие нижней челюсти

1

0.96

14

Отсутствие нижней челюсти, дефекты передних и задних конечностей, «щучья голова»

1

0.96

15

Укорочение верхней челюсти у плода

1

0.96

16

Укорочение верхней челюсти у плода, артрогрипоз

2

1.92

1

2

3

4




передних и задних конечностей, «баранья голова»







17

Укорочение верхней челюсти у плода, артрогрипоз, санкообразность передних конечностей, отсутствие хвоста

1

0.96

18

Помутнение роговицы глаз

35

33.6

19

Помутнение роговицы глаз, дефекты суставов

1

0.96

20

Помутнение роговицы глаз и артрогрипоз суставов

2

1.92

21

Помутнение роговицы глаз, укорочение передних конечностей

1

0.96

22

Помутнение роговицы глаз, искривления в путовых суставах, «баранья голова»



1



0.96



23

Помутнение роговицы, искривление позвоночника, отсутствие хвоста

1

0.96

24

Помутнение роговицы, «заячья губа»

1

0.96

25

Укорочение хвоста

2

1.92

26

Укорочение хвоста, дефекты конечностей

2

1.92

27

Отсутствие хвоста

3

2.88

28

Слепота

2

1.92

29

Слепота, анкилозы суставов конечностей, каудо-ректо-урогенитальный синдром

1

0.96

30

Искривления в путовых суставах

1

0.96

31

Искривления в путовых суставах, пупочная грыжа

1

0.96

32

Артрогрипоз передних конечностей

1

0.96

33

Артрогрипоз передних и задних конечностей

1

0.96

34

Артрогрипоз передних конечностей, слабость связок задних конечностей (искривление, «медвежья лапа»)

1

0.96

36

Анкилоз суставов

2

1.92

37

Искривление позвоночника

1

0.96


Анализ данных таблицы 1 позволяет сделать следующие обобщения. Среди 96 телят-уродов зафиксированных на фото 33% имели укорочение или отсутствие нижней челюсти. У трех телят было зафиксировано укорочение верхней челюсти. У шести телят (примерно 10%) укорочение нижней челюсти было сильно выражено, у трех она практически отсутствовала. Эти телята рождались мертвыми – летальный признак. Другие телята с менее выраженной редукцией нижней челюсти рождались живыми, но жизнеспособность их была низкой. У них были проблемы с приемом кормов, даже молока. Так что этот признак можно отнести к сублетальным и отчасти к полулетальным. У 46 телят (47%) из 96 заметно было помутнение роговицы глаз, а у трех – признаки слепоты без заметных изменений прозрачности хрусталика или роговицы. Тридцать четыре теленка из 46 с помутнением роговицы глаз не имели других выраженных аномалий. У шести телят помутнение роговицы сочеталось с укорочением нижней челюсти, у четырех с аномалиями конечностей. В одном случае с заячьей губой и еще в одном с дефектами осевого скелета. 26 телят имели выраженные аномалии конечностей. Это были анкилозы суставов передних и задних конечностей, артрогрипозы конечностей. В отдельных случаях они встречались как изолированные дефекты, в других в сочетании с другими, например, укорочением хвоста. Последние дефекты укорочение (brachyrie) или отсутствие (anyrie) хвоста. Среди представленных на фото они наблюдаются у 9 телят. У семи телят-уродов были явные признаки диспропорционального развития осевого и периферического скелета или так называемой «лосевидности». П
57
о одному теленку-уроду имели такие дефекты как «волчья пасть», «заячья губа», каудо-ректо-уро-генитальный синдром – когда наряду с отсутствием хвоста, наблюдается недоразвитие мочеполовой системы и прямой кишки. Примерно у половины телят зафиксированы множественные (более одной) аномалии. А у другой половины они встречались как изолированные дефекты. Таким образом, можно говорить о наличии синдромов брахигнатии-артрогрипоз, брахигнатии-лосевидность, брахигнатии-брахиурии. Среди телят родившихся с множественными аномалиями следует выделить еще два дефекта. Первый дефект – «баранья голова». В данном случае речь идет о горбатом, как у овец, профиле нижней части головы. Бараний профиль выделен у пяти телят-уродов. Примечательно, что в двух случаях он сочетался с укорочением верхней челюсти. Еще в двух было сочетание с укорочением нижней челюсти. Четыре теленка с «бараньей головой», кроме того, имели искривления конечностей с анкилозами суставов. Второй дефект анатомически является противоположностью первому, и выглядит подобно голове щуки с явно выраженным вогнутым профилем в месте перехода головы от лобной к лицевой части и определенно удлиненной этой нижней части. Зарегистрировано семь телят с «щучьей головой». У всех телят «щучья голова» сочеталась с укорочением нижней челюсти. У трех, кроме того, были признаки «лосевидности», а у пяти еще одним из составляющих синдрома были дефекты конечностей.

Продолжительность утробного развития телят-уродов, мертворожденных и абортов

Анализ показал, что средняя продолжительность утробного развития телят-уродов составила 9 месяцев 12 дней, мертворожденных 8 месяцев 15 дней. Аборты у коров в среднем происходили, когда возраст плода составлял 5 месяцев и 24 дня. Необходимо отметить, что изменчивость последнего показателя была наиболее выраженной. Так, четыре коровы абортировали на 2-м месяце, три на 3-м, двенадцать коров на 4-м месяце, пятнадцать коров на 8-м месяце стельности.

Генетический анализ уродств у телят айрширской породы в СА «Шугозеро»

Установление роли наследственности в этиологии уродств у телят

Рождение телят с уродствами может быть обусловлено действием генетических или внешних средовых факторов, а также сочетанием тех и других. Роль наследственности определенно прослеживается как одна из главных причин уродств у телят в СА «Шугозеро». Было установлено, что телята-уроды стали рождаться в этом хозяйстве, когда начался приплод от быка Воспитателя 767, закрепленного за стадом в 2001-2002 г.г. От быка Орла 3727, сперма которого использовалась ранее (в 1998-2000 г.г.), телят-уродов в хозяйстве не было. Рождение телят-уродов прекратилось, как только пошел приплод от другого производителя. Примечательно то, что спермой быка Воспитателя 767 было осеменено 25 коров частного сектора. Среди приплода от этих коров зарегистрировано два теленка-урода. У одного из них обнаружены волчья пасть, признаки водянки головного мозга. У второго теленка не развит таз, крипторхизм, узкая вытянутая голова. Еще три коровы из частного сектора абортировали на 4, 5, 6 месяцах стельности. В этот же период семенем быка Воспитателя 767 было осеменено 17 коров в другом хозяйстве Тихвинского района (Сельхозартель «Капшинская»). Из них пять телят родились с различными отклонениями. Три коровы абортировали, у плодов были выраженные уродства. Нами установлено, что в 2001-2002 г.г. спермой быка Воспитателя 767 осеменяли коров в АО «Волховское». В результате зарегистрировано рождение четырех телят с укорочением нижней челюсти и у пяти коров произошли аборты. Были ли среди них уродства не известно. Такие же последствия наблюдались после повторного экспериментального осеменения коров в 2002 году спермой быка Воспитателя 767 в СА «Шугозеро». Приведенные выше данные показывают, что от одного быка – Воспитателя 767 в разных хозяйствах Ленинградской области зарегистрировано рождение телят-уродов, где наряду с гетероморфной картиной их фенотипического проявления, выявляется своего рода маркерный признак или наиболее часто встречающееся уродство. Это укорочение нижней челюсти. Первые случаи этой аномалии в айрширской породе были зарегистрированы в конце 80-х начале 90-х годов прошлого столетия в АО «Алеховщина» и в колхозе им. Ильича Лодейно-польского района Ленинградской области. Отцом этих телят был бык Пижон 3343, который также встречался в родословных части коров, матерей телят-уродов, в СА «Шугозеро». Таким образом, представлены достаточно весомые аргументы для того, чтобы считать генетический фактор причиной уродств у телят, как в последнем хозяйстве, так и в других. В свете этих данных влияние генотипа быка Воспитателя 767 на рождение телят-уродов можно считать доказанным.


Проверка гипотезы моногенного аутосомного рецессивного типа наследования

Предполагается наличие общего предка с обеих сторон родословной. При высокой частоте аномалий обычно общий предок находится в ближних рядах генеалогического древа. В этом случае речь идет о близкородственном разведении или тесном инбридинге. Сравнительный анализ родословных быка Воспитателя 767 и коров, матерей телят-уродов, показал, что у них нет общего предка в трех-четырех рядах родословной . Анализ родословных коров-матерей телят-уродов, абортировавших коров и коров родивших мертвых телят показал, что среди них нет животных, полученных путем близкородственного спаривания. Их отцами были 14 быков, а число дедов по отцу было равно 23-ем. Несмотря на то, что в ряде случаев это были одни и те же быки, замкнутых родословных в пределах четырех рядов родословных не обнаружено. Ни одна из коров, давших нежизнеспособный приплод, не имела значимых родственных связей с их отцом – быком Воспитателем 767. Таким образом, для предположения наследования уродств у телят по моногенному рецессивному типу как бы нет оснований. Однако, если все же предположить, что все или почти все коровы и телки были гетерозиготными носителями тех же рецессивных генов, как и у быка Воспитателя и, если все 114 абортированных плодов гомозиготные носители этих мутаций, как и 92 теленка-урода, соотношение телят без аномалий, равное 418 и с аномалиями, плюс аборты, равное 206, составит 2 : 1. Но если из общего количества абортов вычесть некоторое количество абортированных плодов без аномалий, как обусловленные влиянием внешнесредовых факторов, то соотношение нормальных к аномальным приблизиться к теоретически ожидаемому – 3 : 1, характерному для рецессивных мутаций. Согласно устной информации академика РАСХН П.Н. Прохоренко, полученной от финских селекционеров, от деда быка Воспитателя в Финляндии также рождались аномальные телята.

Проверка гипотезы аутосомного доминантного типа наследования

При таком типе наследования в родословных аномальных животных предполагается наличие общего предка и необязательно с обеих сторон родословной. Как раз такое имело место в исследуемом нами случае. Бык Воспитатель 767 – отец всех телят-уродов. Однако если считать, что наследование шло по моногенному типу, то частота аномальных животных при гетерозиготности этого производителя (Аа) и гомозиготности спариваемых с ним маток (аа) должна быть близкой к 50%. Такая цифра может получиться, если приплюсовать процент уродливых телят (14,7) и остальных мертворожденных, нежизнеспособных и также, если выделить среди абортировавших – уродливых особей, что действительно имело место. Однако, такое соответствие теоретически ожидаемого соотношения нормальных и аномальных телят (50/50) возможно при полной пенетрантности гена. Возникает вопрос, какова причина полной и неполной пенетрантности доминантного гена. Важно предположить, что основа неполной пенетрантности доминантного гена лежит во взаимодействии этого главного гена с другими генами и зависит от той генетической среды, в которой данный ген функционирует.

Проверка гипотезы сцепленного с полом наследования

Когда мутантный ген локализован в половой Х-хромосоме млекопитающих, аномалия проявляется преимущественно у особей мужского пола, реже женского, если признак нелетальный. В таких случаях речь идет о сцепленном с полом наследовании. С целью исследования такого варианта передачи гена и проявления признаков составили список коров, давших нежизнеспособный приплод, включая уродов, мертворожденных, аборты, сведения об их предыдущих отелах, в том числе пол теленка. Исходя из имеющейся информации о половой принадлежности телят-уродов, проведены расчеты соотношения полов среди телят-уродов. Это соотношение оказалось сдвинутым в сторону мужского пола. Среди телят-уродов 79,76% (19 из 24) было бычков и только 29,24% (5 из 24) телочек. Аналогичная картина выявилась при анализе удельного веса бычков и телочек, родившихся от этих же коров (матерей телят-уродов) в предыдущих отелах. Из общего числа приплода 98 телят – 63% были бычки и 35% телочки. В тоже время соотношение бычков и телочек в предыдущих отелах среди абортировавших коров и коров, родивших мертвых телят, соответствовали теоретически ожидаемым. Так, в группе абортировавших в последний отел коров в предыдущих отелах родили 106 бычков и 115 телочек (соотношение 47,91% к 52,09%). В группе коров, давших в последний отел мертвых телят, за предыдущие отелы получено 44 теленка, из них 21 бычок (47,73%) и 23 (52,27%) телочек. Возникает вопрос, случайны ли отклонения в сторону именно мужского пола среди телят-уродов, родившихся от быка Воспитателя 767, и их полубратьев по матерям, потомков других производителей. Отмечено, что распределение телят по полу родившихся в предыдущих отелах, от коров, давших после спаривания с Воспитателем 767 уродливых бычков, соответствовало теоретически ожидаемому соотношению 1:1. В целом в данной группе приплод был от 15 быков, и общее количество телят составило 344 головы, среди которых 49,41% бычков, 50,59% телочек. Незаметно существенных отклонений от теоретически ожидаемых в соотношении полов среди потомков разных быков, если исключать тех, от кого получено малое количество телят. Хотя из-за малого объема этого материала значение χ2 оказалось невысоким (1,16 и 0,28) все же выраженное преобладание бычков над телочками в группе коров, давших телят-уродов, позволяет предположить, что возникновение определенных типов аномалий не обошлось без участия генов, локализованных в половой Х-хромосоме.

Проверка гипотезы ограниченного полом наследования

Исходя из определения С.М. Гершензона, 1983 «ограниченными полом называются такие наследственные признаки, которые проявляются только у данного пола или выражение которых различно у разных полов. Они могут определяться как аутосомными генами, так и генами, лежащими в половых хромосомах». Ф.Б. Хатт, 1969 указывает «некоторые признаки совершенно независимо от сцепления с полом проявляются только у особей одного пола. Это так называемые ограниченные полом признаки». Хатт, 1969 замечает, что есть и другие признаки, проявляющиеся у особей обоего пола, но у одного пола в большей степени и чаще, чем у другого. Это признаки, контролируемые полом. По Хатту, признаки, ограниченные полом и признаки, контролируемые полом, могут быть обусловлены аутосомными генами. На наш взгляд, характер или тип генетической детерминации уродств у телят в СА «Шугозеро» следует рассматривать с позиции взаимодействия олигогенов, одни из которых локализованы в аутосомах, другие же в Х-хромосоме.

Проверка гипотезы полигенного наследования


Такой вариант генетической детерминации признаков предполагает однонаправленное аддитивное или суммирующее действие значительного числа генов. В случаях полигенной детерминации аномальных признаков речь должна идти о мутантных генах, которые проявляются при определенном их количестве или пороге. Последнее означает, что в этиологии аномалий определенную роль играет вредный фактор внешней среды. Поэтому наряду с полигенным употребляют термин мультифакториальное наследование. Когда в результате анализа типа наследования аномалий не удается получить данные по сегрегации фенотипов (норма : аномалия), соответствующие правилам Менделя (теоретически ожидаемые генотипы), и трудно дать объяснения этому, говорят о семейном или полигенном наследовании. При этом, как правило аномалии встречаются с высокой частотой в определенных родственных группах – линиях и семействах, и с низкой частотой в других родственных группах, а в третьих они вовсе не обнаруживаются. Для оценки степени влияния генотипа на проявления такого признака рассчитывают коэффициенты наследуемости. В них заложены расчеты Фишера и постулаты Клункера, описание которых дают Визнер, Виллер, 1979. Априори считается, что «вклад» в формирование аномалии у потомка в равной степени вносят и мать, и отец. В нашем случае, когда поменяли отца, от тех же матерей получили здоровое потомство. Матери же из экспериментальной группы, осемененные тем же быком Воспитателем 767, снова дали нежизнеспособный приплод. Учитывая отсутствие значимых родственных связей между родителями аномальных потомков и высокую частоту уродств у телят от быка Воспитателя 767, в разных хозяйствах более аргументированным выглядит предположение о доминантном характере проявления этих признаков, гипотеза о полигенном наследовании не имеет под собой основания.

Гетероморфность и гетерогенность аномалий у телят айрширской породы в СА «Шугозеро» и их причины

Основной причиной, которой оперируют до сих пор зооветспециалисты в хозяйствах в случаях, когда рождается теленок с аномалиями, это отметки в графе приплод – «урод». Однако более тщательная работа коллектива специалистов в СА «Шугозеро» показала, что уродства телят были различными по морфологии и степени выраженности, т.е. они были фенотипически неоднородными, когда в популяции наблюдалась выраженная гетероморфность уродств телят. Конкретно об этом речь шла выше при рассмотрении спектра уродств у телят в СА «Шугозеро». Возникает вопрос, как можно объяснить столь широкий спектр уродств у телят от одного быка. Являются ли они следствием плейотропного эффекта одного гена или это результат взаимодействия нескольких мутантных генов. Следует указать, что голштинская и айрширская породы имеют общие генетические корни. Большинство исследователей (Роде О., Эйсбейн К., 1886; Кулешов П.Н., 1889; Червинский Н.П., 1902; Иваникевич О.Н., 1912; Придорогин М.И., Fowler L., 1932), занимавшихся изучением скота айрширской породы, утверждают, что он произошел от скрещивания местного скота с голштинской, титсватерской, голландской, хайландской, девонской, шортгорнской, гернсейской и джерсейской породами (цит. по Н.Г. Дмитриеву, 1982). В свете этих данных можно предположить, что мутация, вызывающая CVM-синдром, первоначально возникла у голштинского или голландского скота и мигрировала к айрширам при ее формировании и скрещивании с данными породами. Но, может быть, бык Воспитатель 767 оказался носителем нескольких «независимых» друг от друга летальных и полулетальных мутаций. Такая ситуация рассматривалась А.И. Жигачевым, 1986 при изучении наследования уродств в костромской породе, когда бык Бурхан был признан носителем нескольких рецессивных генов и давал потомство с разными формами аномалий. Причем эти аномалии имеют как разнонаправленное выражение, так и однонаправленное. Так наряду с преобладанием у телят укорочения нижней челюсти наблюдали редукцию верхней челюсти. Опять же является ли это разной манифестацией одного гена или разных генов. Наряду с карликовыми телятами рождались очень крупные телята – «гигантизм». Следует указать на определенные сходства морфологической картины уродств у телят айрширской породы в СА «Шугозеро» и CVM-синдромом в голштинской породе. В информации ассоциации по разведению голштинов, 2002 отмечают, что это сложное уродство позвоночника, включающее наиболее заметные изменения:

  • уродливые ноги с негнущимися суставами, с искривленными негнущимися бабками;

  • укороченная шея;

  • аномальный изгиб позвоночника.

Представленный на сайте httр://www.holsteinusa.com/html/cvm.html теленок с указанным синдромом действительно имеет сходство с рядом уродств телят в СА «Шугозеро». Вызывают особый интерес в этой информации сведения относительно характера наследования CVM-синдрома и его фенотипического проявления. Отмечается, что этот синдром контролируется рецессивным мутантным геном. Указано, что если теленок имеет в генотипе 2 рецессивных гена (гомозиготность), то он обычно погибает в эмбриональной стадии развития, либо корова телится раньше срока за 2 недели и теленок рождается мертвым. Таким образом, синдром наследуется по моногенному рецессивному типу, а мутантный ген обладает множественным (плейотропным) действием с летальным проявлением, как на ранних, так и на поздних стадиях внутриутробного развития.

Отметим еще некоторые аналогии:

Так у одних телят был вогнутый профиль головы, у других горбатый («бараний»). Отмечено также определенное сходство отдельных телят, имевших аномалии позвоночного столба, с описанным ранее и получившим название «лосевидные телята». Однако, при сопоставлении фотографий таких животных айрширской породы из СА «Шугозеро» и тех, что в Норвегии в опландской породе, обнаружили очевидные различия, которые выражались, прежде всего, в том, у норвежских опландских телят было заметно укорочение всех участков осевого скелета, особенно шейной части. У айрширских телят шея была нормальной длины, а туловище явно укороченным. Сходным у тех и других была редукция хвостовых позвонков и выраженная длинноногость. Для разграничения различий этой аномалии и ранее описанной в норвежской опландской породе и обнаруженные у телят айрширской породы присвоить дополнительные обозначения: perocormie (short spine) I типа и perocormie (short spine) II типа (айрширская порода). Объяснение выраженной гетероморфности и разной экспрессивности уродств у телят можно дать, если рассмотреть современные трактовки молекулярно-генетических механизмов генных мутаций. Они делятся на точечные и структурные. Среди структурных выделяют так называемые динамические мутации. У человека к настоящему времени известно порядка 20 наследственных заболеваний, обусловленных динамическими мутациями. При этом наиболее обширную группу составляют заболевания с аутосомно-доминантным типом наследования. При всех заболеваниях с динамическими мутациями тяжесть клинических проявлений прямо пропорционально коррелирует с величиной экспансии тринуклеотидных повторов, то есть со степенью тяжести генетического дефекта. Динамический характер мутаций и тенденция к нарастанию числа повторов при передаче гена является молекулярной основой феномена антиципации, свойственного доминантным «тринуклеотидным» заболеваниям и заключающеюся в появлении более ранних и тяжелых случаев в каждом последующем поколении. Было показано также, что необычные свойства динамических мутаций объясняют так называемый эффект отцовской (материнской) передачи, характерных для некоторых из этих заболеваний. В широком смысле слова данный феномен (зависимости фенотипических проявлений заболевания от пола родителя, передавшего мутантный аллель) носит название импритинга. Так при болезни Гентингтона у человека наиболее тяжелый фенотип развития обычно проявляется при наследовании болезни по отцовской линии. Это связано с преимущественной нестабильностью мутантного аллеля и драматическим нарастанием повторов в мужском гаметогенезе. Различная степень экспансии повторов лежит также в основе весьма варьирующей эксперессивности и тринуклеотидных заболеваний – от субклинических и «мягких» форм до тяжелых развернутых случаев (С.Н. Иллариощкин, 2004).

Анализ изменений показателей воспроизводства стада и молочной продуктивности коров после вспышки массовых уродств у телят в СА «Шугозеро»

Массовое рождение телят-уродов, аборты с признаками уродств привели к резкому нарушению возможностей стабильного воспроизводства стада в хозяйстве за счет собственных ресурсов. Так 2003 году в стадо было введено только 9,5% нетелей. В 2004 году хозяйству была оказана единовременная финансовая помощь со стороны АПК Ленинградской области. Средства были направлены на закупку нетелей, что позволило вместо выбракованных коров ввести 166 нетелей или 20,7%. Однако поголовье коров в 2004 году было сокращено на 68 голов против 2003 года. В 2005 году ремонт стада составил всего лишь 13,3%. Важнейшим показателем оценки производственной деятельности хозяйства является выход телят. Он позволяют сделать заключение о том, что уровень воспроизводства стада после замены быка Воспитателя 767 резко вырос. Выход телят в 2003 году составил 82 головы на 100 коров, в 2004 – 90, а в 2005 году хозяйство получило 92 теленка на 100 маток. Одновременно с этим наблюдался определенный рост удоев в расчете на одну фуражную корову на 107,4%. Если в 2003 году было получено 3602 кг, то в 2005 году – 3869 кг. Однако валовое производство молока в 2005 году против 2003 года составило 97,5%, что связано с уменьшением количества коров и ввода первотелок из-за массовых уродств телят в два предыдущих года.

Таблица 2. Показатели ввода нетелей в основное стадо коров СА «АФ Шугозеро»

Год

Всего КРС

В т.ч. коров

Нетели

n

%

n

%

2003

1785

868

48,6

83

9,5

2004

1676

800

47,7

166

20,7

2005

1560

800

51,3

107

13,3

Выводы

  1. На примере СА «Шугозеро» показано, что уродства и аномалии могут быть главным фактором существенного снижения уровня воспроизводства крупного рогатого скота и валового производства молока.

  2. На основе комплекса ветеринарно-генетических методов изучена и установлена роль наследственности в этиологии массовых случаев рождения телят с уродствами и аномалиями.

  3. Проведена проверка гипотез относительно типа генетической детерминации уродств у телят, позволившая остановиться на доминантном характере наследования.

  4. Установлено, что источником распространения мутантных генов в четырех субпопуляциях айрширской породы оказался бык-производитель Воспитатель 767, используемый в системе крупномасштабной селекции товарных и племенных стад.

  5. На основе анатомо-морфологического принципа проведена классификация нозологической картины у телят, в результате чего установлено, что наиболее часто обнаруживаемой были укорочение или отсутствие нижней и реже верхней челюсти. Эти дефекты сочетались с аномалиями глаз, конечностей, осевого скелета.

  6. Широкий спектр уродств теоретически объясняется мутацией протяженного участка ДНК соответствующего нескольким экзонам.

  7. Уродства у телят-потомков быка Воспитателя 747 рассматриваются как следствие динамических мутаций, «импритинга», связанных с генетической нестабильностью в его геноме.

  8. Выраженная гетероморфность аномалий у телят – потомков одного быка рассматривается с позиций плейотропного действия генов, их взаимодействия с другими аллелями.

  9. Низкая экспрессивность признака «укороченная челюсть» в предшествующих поколениях могла быть причиной интродукции мутантного гена, обусловливающего этот и другие дефекты, из одной популяции айрширской породы в другую, о чем свидетельствуют как собственные экспериментальные данные, так и сведения из мировой литературы.

  10. Для более полной оценки уровня генетического груза необходимо наряду уродствами учитывать процент эмбриональной смертности, абортов в потомстве быков-производителей.

Предложения

В связи с распространением уродств и аномалий в потомстве быка Воспитателя 767 его сперма должна подлежать выбраковке.

  1. При отборе ремонтных быков айрширской породы для воспроизводства в сети искусственного осеменения рекомендуется проводить тщательный анализ «недокусов» или «перекусов» как у самих будущих производителей, так и их ближайших родственников.

  2. Во избежание интродукции вредных мутаций в популяции крупного рогатого скота айрширской породы при импорте племенного материала, предназначаемого для интенсивного использования в системе крупномасштабной селекции, рекомендуется при оформлении договоров купли-продажи требовать «сертификаты качества», в которых гарантируется отсутствие скрытых генетических дефектов, выявленных в айрширской породе, список которых предлагается для руководства.

  3. В хозяйствах, занимающихся разведением крупного рогатого скота айрширской породы, наладить регистрацию уродств и аномалий в журналах осеменений и отелов, племенных карточках коров и других документах зооветеринарного учета. Оперативно представлять такую информацию в племобъединения, ветеринарно-генетические центры.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

В рецензируемых журналах:

Эрнст Л.К., Жигачев А.И., Кудрявцев В.А. «Мониторинг генетического груза в черно-пестрой, голштинской и айрширской породах крупного рогатого скота».

Зоотехния, 2007, № 3, с. 5-10

В сборниках научных трудов и вестниках ВУЗов:

Кудрявцев В.А. «Спектр врожденных генетически обусловленных аномалий у телят-потомков одного быка».

В.А. Кудрявцев, А.И. Жигачев. «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». Сборник научных трудов № 136. – СПб, издательство СПбГАВМ, 2004 г., с. 56-58

В материалах международных симпозиумов и конференций: Кудрявцев В.А. «Генетический груз у крупного рогатого скота айрширской породы».

А.И. Жигачев, В.А. Кудрявцев. Ученые записки Витебской государственной академии ветеринарной медицины. Витебск, 2004, с.83-84

Кудрявцев В.А. «Генетическая эрозия как причина массовых уродств, первичных иммунодефицитов у крупного рогатого скота».

А.И. Жигачев, В.А. Кудрявцев. Материалы Международной научной конференции по патофизиологии животных. Санкт-Петебург, издательство СПбГАВМ, 2006 г., с. 62-63.

В монографиях: Кудрявцев В.А. «Генетический анализ укорочения нижней и верхней челюсти и некоторых других аномалий у телят айрширской породы».

В книге Л.К. Эрнст, А.И. Жигачев «Мониторинг генетических болезней животных в системе крупномасштабной селекции». Москва. Издательство Россельхозакадемии, 2006, с. 130-147.






Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы icon2. Строение таза у собак породы голден ретривер для выведения плода… 6
Лишь у собак породы различаются не только окрасом и размером шерсти, а также массой тела, формой черепа, ростом, объемом скелетной...

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы iconАндреева нэля анатольевна продуктивные и биологические показатели коров различной селекции в условиях Зауралья

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы iconПеречень вредных производственных факторов, профессий при которых проводятся обязательные медицинские осмотры

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы icon1 История породы

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы icon1. История возникновения породы

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы iconПороды кур- каталог

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы icon1. История возникновения породы

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы icon1. История возникновения шотландской вислоухой породы

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы icon» - «Состояние и перспектива развития тянь-шаньской полутонкорунной породы овец в Нарынском районе».(окон вар)
«Состояние и перспектива развития тянь-шаньской полутонкорунной породы овец в Нарынском районе».(

Мониторинг вредных мутаций в системе крупномасштабной селекции айрширской породы icon65летняя пенсионерка, в прошлом учительница литературы и русского языка, без вредных привычек и психиатрического анамнеза, страдающая опухолью паратиреоидных ж

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU