Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции icon

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции





Скачать 337.59 Kb.
НазваниеВойтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции
Дата конвертации31.05.2013
Размер337.59 Kb.
ТипАвтореферат диссертации




На правах рукописи



ВОЙТОВА

КСЕНИЯ ВАСИЛЬЕВНА


ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ



      1. – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук


Новосибирск – 2011

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.


Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор
Глотов Александр Гаврилович



Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор
Храмцов Виктор Викторович,





кандидат ветеринарных наук
Зайцев Юрий Николаевич


Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследова-тельский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук







Защита состоится « 24 » мая 2011 г. в «12-00 » часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01. при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348–44–62.


С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.


Автореферат разослан «___» ________ 2011 г.





Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Стеблева

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Респираторные болезни являются важной причиной экономического ущерба в молочном скотоводстве. Они приводят к падежу или снижению скорости роста животных, затратам на лечение, диагностические и профилактические мероприятия (Н.Н. Крюков и соавт., 1976; В.А. Мищенко и соавт., 2000; Н.Ю. Басова, 2002; О.Г. Петрова и соавт., 2002; К.П. Юров и соавт., 2003; А.Г. Глотов и соавт., 2008; Н.Р. Будулов, 2009; D.G. Bryson, 2000; K.A. Brogden et al., 2002).

Одним из этиологических агентов респираторных болезней является респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), относящийся к семейству Paramyxoviridae, роду Pneumovirus. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота (РСИ КРС) регистрируется во всех странах мира с интенсивным типом ведения животноводства (M. Elvander, 1996; L.E. Larsen, 2000; S. Hagglund, 2005; A.F. Antonis et al., 2010; B.W. Brodersen, 2010; C. Luzzago et al., 2010). Первые сообщения о ней в нашей стране относятся к 1975 году (В.В. Гуненков и соавт., 1975). Изучению болезни и разработке средств и методов диагностики были посвящены работы Г.А. Халенева (1976), А.В. Васильева и соавт. (1988), И.Я. Строгановой (1989), Т.М. Кочиш (2004), И.Н. Матвеевой (2008) и других исследователей.

В настоящее время актуальным является изучение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в хозяйствах по производству молока, особенно с наличием импортированного скота, а также разработка эффективных методов диагностики болезни с целью совершенствования противоэпизоотических мероприятий.

Вирусологическая диагностика болезни малоэффективна, поэтому преимущество имеют молекулярные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) (E.J. Dubovi, 1993; J.-F. Valarcher et al., 2007). Разработка ОТ-ПЦР для выявления РСВ КРС во многих странах началась в конце прошлого столетия. В литературе имеются сообщения о выявлении вируса в пробах биоматериала от больных животных (S. Vilcek et al., 1994; L.E. Larsen et al., 1999; V. Valentová et al., 2003; R.S. Almeida et al., 2005; M. Boxus et al., 2005; J.-F. Valarcher et al., 2007; E. Timsit et al., 2009; O. Angen et al., 2009).

На момент начала наших исследований в РФ законченных разработок в этом направлении не было.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка полимеразной цепной реакции для диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и изучение ее диагностической и экономической эффективности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах региона Сибири с учетом наличия в них импортированного и местного скота по результатам серологических исследований;

2. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ОТ-ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, а также – влияние сроков хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах на пригодность к исследованию в ОТ-ПЦР;

3. Изучить диагностическую и экономическую эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях, установить частоту выявления РСВ в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.

Научная новизна. Показано широкое распространение РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства. Разработана ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина F, показана ее высокая эффективность при диагностике болезни в производственных условиях. Определены оптимальные сроки хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах. Изучена частота выявления вируса в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellaceae.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты создают перспективы использования ОТ-ПЦР в диагностике РСИ КРС в качестве основного вирусологического метода в комплексе с серологическими исследованиями, что будет способствовать оптимизации противоэпизоотических мероприятий.

Материалы диссертации представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли РСВ в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота на крупных молочных комплексах. Они могут быть использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии, патогенеза РСИ КРС и смешанных вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу.

Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке рекомендаций: «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 26.01.2010 г.)

Основные положения диссертационной работы использованы при разработке научно-технической документации на «Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499).

Апробация полученных результатов. Материалы диссертационной работы доложены на: международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИиТИБП, «Научные основы производства биологических препаратов», Щелково, 2009; II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины», Новосибирск, 2010; XIV международной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов  «Молодость, талант, знания агропромышленному комплексу России», посвященной 80-летию УГАВМ, Троицк, 2009; VI международной научной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии, «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Краснообск, 2010; XIII международной научно-практической конференции «Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана», Новосибирск, 2010; VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010», Москва, 2010 г.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации («Ветеринария», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Вестник КрасГАУ»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована одним рисунком и 10 таблицами. Список литературы включает 246 источников, в том числе 188 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты изучения распространения и характер проявления РСИ КРС в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства с наличием импортного скота и без него;

2. Результаты разработки и изучения эффективности полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для диагностики РСИ КРС в производственных условиях.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2008–2011 гг. в лаборатории биотехнологии – диагностический центр ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.

Изучение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в Сибири. В связи с тем, что плановые исследования на вирусные инфекции не предусмотрены нормативной документацией, при изучении распространения РСИ КРС использовали результаты собственных исследований.

Исследовали 538 проб сыворотки крови от телят до 6-месячного возраста, 584 пробы от нетелей, телок и коров. Постановку реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) проводили с помощью набора для серодиагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота (ООО «Агровет», Москва).

При изучении распространения болезни использовали серологический метод. Исследовали пробы сыворотки крови, отобранные от животных однократно. Высчитывали средний процент проб, содержащих антитела к вирусу, от числа поступивших из хозяйств с наличием или отсутствием вспышек респираторных болезней.

С целью установления сероконверсии к вирусу, свидетельствующей об его активной циркуляции, исследовали парные пробы сыворотки крови телят, нетелей и коров, отобранные с интервалом 30 дней. Полученные пробы хранили при минус 20ºС и исследовали одновременно.

Исследования проводили в 27 хозяйствах трех регионов Сибири: Тюменской и Новосибирской областей и Красноярского края с наличием или отсутствием импортного скота.

Праймеры для ОТ-ПЦР. Поиск праймеров осуществляли на основе анализа полного генома штамма РСВ КРС А51908, представленного в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/GenBankSearch.html), при помощи пакета программного обеспечения “Lasergen”, Alignment-serves и CLUSTAL. Праймеры для детекции кДНК были выбраны на последовательности района гена гликопротеина F, обладающего высокой консервативностью. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестировали на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе “Vector NTI Suitе” с последовательностями генома вируса парагриппа-3 (ПГ-3) КРС.

Окончательный выбор праймеров основывался на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и РНК различных штаммов вируса РСИ КРС, высокая температура отжига (GC-метод), большая длина консенсусов.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе марки «Терцик». Продукты ОТ-ПЦР анализировали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном Трис-боратном буфере при напряжении 10 В/см. Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор-UVT-1». Положительными считались пробы, дающие полосу фрагмента кДНК, соответствующую 381 п.н. Исследования проводили в трех повторностях.

Штаммы и изоляты вирусов. В работе использовали два штамма РСВ КРС: РС-Б № 3, представленный проф. Красочко П.А., и К-18, выделенный в ГНУ ИЭВСиДВ.

В опытах по изучению специфичности ОТ-ПЦР дополнительно использовали вирус ПГ-3 (штамм ПТК), вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (штамм ВК-1), вирус классической чумы свиней (вакцинный штамм), герпесвирус КРС 1-го типа (штамм Оренбург), аденовирус КРС 1 типа (штамм BV-10), риновирус КРС 1-го типа (штамм SD-1), неинфицированные культуры клеток Vero и ТЭБ.

Выделение РНК и получение кДНК вируса. Выделение РНК вируса осуществляли стандартным способом с использованием коммерческого набора «Рибо-сорб» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора). Обратную транскрипцию для получения кДНК проводили при помощи коммерческого набора «Реверта-L» производства того же института. В пробирку, содержащую 9,5 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 mM Tris-HCl [pH 8.3], 3 мМ MgCl2, 75 mM KC1, 10 мМ DTT), 0,1 мМ dNTP, 0,1 мкг праймера для ОТ), и 0,5 мкл ревертазы из набора «Реверта-L», добавляли 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивали и помещали в термостат при 37ºС на 30 минут. Затем добавляли 20 мкл ДНК-буфера, тщательно перемешивали и использовали для постановки ОТ-ПЦР.

Проверка чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР. Для определения чувствительности реакции контрольный штамм вируса РСБ № 3 титровали методом 10-кратных разведений до 10–7 ТЦД50/мл, каждое разведение исследовали в ОТ-ПЦР. Испытания специфичности ОТ-ПЦР проводили с использованием панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованных вирусологическими методами.

Для изучения эффективности ОТ-ПЦР в производственных условиях исследовали 273 пробы биоматериала. В том числе: 45 проб носовых выделений, 24 – трахеального и бронхиального экссудатов, 180 – бронхов и легких больных и вынужденно убитых с диагностической целью животных. Пробы биоматериала транспортировали в лабораторию в замороженном состоянии или в транспортной среде в течение не более 24 часов с момента их отбора. При отсутствии возможности доставки проб в течение указанного срока, их замораживали однократно и транспортировали в лабораторию в термосе со льдом.

Пробы органов и тканей перед исследованием растирали в отдельных фарфоровых ступках со стерильным песком, гомогенизировали и готовили 10%-ые суспензии на физиологическом растворе, после чего центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Полученные суспензии исследовали в ОТ-ПЦР. Смесь переносили в пластиковые пробирки емкостью 1,5 мл, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК использовали 100 мкл осветленного супернатанта. Густые пробы носовых выделений и экссудата разводили стерильным физиологическим раствором (примерно 1:5). Полученную суспензию тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветленного супернатанта.

Изучение влияния сроков хранения при различных температурных режимах на пригодность РНК вируса к исследованию в ОТ-ПЦР. Полученные суспензии внутренних органов, а также выделенной РНК, фасовали в пластиковые пробирки, помещали на длительное хранение при плюс 4ºС и минус 18ºС. Срок наблюдения составлял 12 месяцев. Через каждые 30 дней пробы извлекали и подвергали исследованию в ОТ-ПЦР.

Бактериологические исследования. Выделение и типизацию бактерий сем. Pasteurellaceae проводили согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц (Москва, 1992).

Экономическую эффективность лечебно-профилактических мероприятий определяли согласно методическим рекомендациям по определению экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утвержденным ГУВ МСХ и П РФ 21.02.1997 г. Дополнительно использовали методические рекомендации по оценки социально-экономической эффективности применения метода биочип-диагностики во фтизиатрии (Москва, 2009).

Математические расчеты. Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р<0,05. Для обработки полученных данных использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office 7.0».

Подробные методики исследований приведены по мере изложения материалов собственных исследований в начале соответствующих подразделов.

Личное участие. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н., профессор Т.И. Глотова, с.н.с. О.В. Кунгурцева, с.н.с., к.в.н. С.В. Котенева и А.В. Нефедченко, которым автор выражает глубокую благодарность.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Распространение и характер проявления РСИ КРС
в хозяйствах региона Сибири


Результаты исследований показали, что в настоящее время РСИ КРС имеет широкое распространение в хозяйствах с интенсивным типом ведения животноводства региона Сибири. Однако инфицированность животных по различным административным территориям несколько различается.

Так, серопозитивность животных к вирусу составила в среднем по Тюменской области 66,6%, Новосибирской – 43,8; по Красноярскому краю – 38,4%.

По результатам обследования хозяйств Новосибирской области установили, что у 92,6% телят до 30-дневного возраста отсутствовали колостральные антитела к вирусу. Серопозитивность телят 1–6-месячного возраста составила 25,5%, а средние титры антител – 2,1±0,33 lg2, телят от 6 месяцев и старше – 50,0% (2,4±0,67 lg2), телок – 66,7% (5,2±0,14 lg2), а коров и быков – 76,3% (4,5±0,09 lg2). Средние титры антител у животных всех половозрастных групп составили 3,02±0,47 lg2.

Инфицированность животных вирусом была выше в хозяйствах Тюменской области, что, возможно, связано с интенсивным типом ведения животноводства (с высокой молочной продуктивностью и концентрацией животных на единицу площади) и наличием импортного скота.

Серопозитивность телят до 30 дней составила 45,7%, а величина средних титров антител – 1,9±0,42 lg2, телят 1–6-месячного возраста – 29,9% (1,81±0,06 lg2), телок – 100% (5,4±0,43 lg2), нетелей – 82,6% (5,1±0,02 lg2), коров и быков – 86,7% (4,8±0,19 lg2). Величина средних титров антител у животных всех половозрастных групп составила 3,8±0,43 lg2.

Более высокая инфицированность животных этого региона связана, вероятно, с более активной циркуляцией вируса среди телок и нетелей, завезенных в хозяйства по импорту (телки – 5,4±0,43 lg2; нетели – 5,1±0,02 lg2).

Особый интерес представляли три крупных хозяйства Красноярского края, куда не было ввоза импортного скота. Серопозитивность животных всех обследованных категорий составила в среднем 38,4%. В том числе: телят до 30 дней – 34,6% с величиной средних титров антител – 2,5±0,72 lg2, телят 1–6-месячного возраста 20,4% (1,5±0,03 lg2). Установлено, что 35,5% телят до 30 дней не имели колостральных антител. Серопозитивность коров составила 75%, однако титры антител к вирусу у них достигали значений 7,4±0,21 lg2, что было выше, чем у животных этой категории в хозяйствах Новосибирской и Тюменской областей (4,5±0,09 lg2 и 4,8±0,19 lg2 соответственно). Разница достоверна при Р<0,05.

Титры антител к вирусу у телят до одного месяца были также выше (2,5±0,72 lg2), чем у животных этих областей (0,9±0,57 и 1,9±0,42 lg2 соответственно). Это можно объяснить тем, что на момент исследований в данных хозяйствах регистрировали вспышки респираторных болезней среди телят до 6-месячного возраста и коров.

Таким образом, уровень серопозитивности к вирусу повышался с возрастом животных, а титры антител достоверно повышались к 12-ти месяцам и старше. Высокие титры антител к вирусу у коров, вероятно, являлись следствием его активной циркуляции среди этой категории животных, являющейся источником возбудителя для неимунных телят.

Сероконверсию (4 – 32-кратное повышение титров антител) к вирусу чаще выявляли у телят в возрасте 4–6 месяцев и коров. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был более высоким (до 256-кратного).

Течение болезни и характер клинических признаков условно разделили на три формы.

Первая – сверхострая форма инфекции характеризовалась угнетением животного, повышением температуры тела до 42ºС, снижением молочной продуктивности у коров, выделением обильной пены из ротовой полости, хрипами, кашлем, конъюнктивитами и высокой летальностью.

На вскрытии регистрировали интерстициальную пневмонию вплоть до полного разрушения паренхимы, бронхиты, увеличение и геморрагическое воспаление легочных лимфоузлов и легочную или бронхиальную эмфизему. Гибель животных наступала в течение нескольких дней, несмотря на проводимое лечение.

Вторая – острая форма, при которой у животных регистрировали бронхиты и интерстициальную бронхопневмонию. При всех клинических формах течение болезни осложнялось развитием вторичной микрофлоры (пастереллез) с выделением из легких павших и вынужденно убитых животных всех возрастов Mannheimia haemolytica и Pasteurella multocida. На вскрытии выявляли петехиальные кровоизлияния на миокарде и фибринозную бронхопневмонию.

В третьем случае болезнь у животных протекала субклинически.

В некоторых хозяйствах, неблагополучных по бронхопневмониям, произошло наслоение РСИ на хроническое течение сальмонеллеза и диплококковой септицемии у телят. Кроме этого у коров и телят регистрировали инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею-болезнь слизистых оболочек, что было подтверждено вирусологическими и ретроспективными серологическими исследованиями. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был очень высоким (до 128-кратного), что на наш взгляд, свидетельствует о его ведущей роли в этиологии массовых вспышек респираторных болезней.

Таким образом, респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота широко распространена в Сибири и носит энзоотический характер. На характер эпизоотической ситуации и проявления клинических признаков болезни влияет интенсификация молочного животноводства, концентрация животных на ограниченных территориях. Огромное значение имеет ввод новых животных в стадо, особенно поступающих по импорту. В крупных хозяйствах циркуляция вируса может быть непрерывной за счет транзитной инфекции у коров и телят, что обеспечивает постоянный риск возникновения повторных вспышек болезни.


2.2.2. Разработка ОТ-ПЦР для диагностики РСИ КРС

2.2.2.1. Подбор праймеров для постановки ПЦР

Для создания диагностической тест-системы осуществляли подбор специфических олигонуклеотидных праймеров, поиск которых проводили на основе анализа полного генома штамма вируса А51908, представленного в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/GenBankSearch.html). Праймеры для детекции кДНК были выбраны на последовательности района гена гликопротеина F. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестировали на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе “Vector NTI Suite”.

Окончательный выбор праймеров основывался на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и РНК различных штаммов вируса РСИ КРС, высокая температура отжига (GC-метод), большая длина консенсусов.

В результате были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, комплементарные нуклеотидной последовательности 6308 – 6689 и 6309 – 6329 соответственно и фланкирующие последовательность гена гликопротеина F размером 381 пар оснований (п.о.).

2.2.2.2. Компоненты ПЦР

Реакционная смесь для проведения ПЦР содержит в 20 мкл: 2,5 мкл буфера для Taq ДНК-полимеразы (60 мМ Tris-Hcl (pH 8,5 при 25°С), 1,5 мМ MgCl2; 25 мM KCl; 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100); 2,5 мкл 2,5мМ dNTP (смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов); по 5 мкл каждого праймера с концентрацией 1мМ; 1,25 ед. активности термостабильной Taq ДНК-полимеразы; оставшийся объем занимает деионизованная вода. В смесь вносили кДНК в объеме 5 мкл. Поверх смеси наслаивали 2 капли минерального масла. Все манипуляции по приготовлению реакционной смеси осуществляли на тающем льду.

2.2.2.3. Отработка оптимального режима амплификации
и проверка чувствительности ПЦР


С целью отработки оптимального режима амплификации в ПЦР рассматривали три различные схемы ее проведения. В качестве матрицы использовали штамм «РСБ №3» в разведениях 10–1 – 10–7.

Схема 1.: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 15 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 15 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С – 2 минуты. В результате проведенной реакции все разведения вируса дали отрицательный результат.

Схема 2.: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Далее 40 циклов по схеме: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С – 2 минуты. Чувствительность ОТ-ПЦР при данной схеме составила 10–1ТЦД50/мл.

Схема 3.: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С – 2 минуты. В данном случае чувствительность составила 10–5 ТЦД50/мл. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Чувствительность ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина F


Схема

Результаты исследований в ОТ-ПЦР

Разведения вируса, ТЦД 50/мл

10–1

10–2

10–3

10–4

10–5

10–6

10–7

1















2

+













3

+

+

+

+

+





Примечание: «+» – положительная проба; «–» – отрицательная проба.


Результаты показали, что наиболее оптимальным режимом проведения ОТ-ПЦР является схема № 3, обеспечивающая выявления РНК вируса в пределах разведения 10–5ТЦД50/мл.

Таким образом, нами был отработан оптимальный режим времени для проведения ПЦР, состоящий из следующих циклов: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Далее 35 циклов по схеме: денатурация при 95°С – 30 сек., отжиг при 60°С – 30 сек., синтез при 72°С – 45 сек. Синтез в последнем цикле при 72°С – 2 минуты.


2.2.2.4. Определение специфичности ОТ-ПЦР

Испытания специфичности ОТ-ПЦР проводили с использованием панели контрольных образцов, предварительно охарактеризованных вирусологическими методами. Результаты представлены в таблице 2.


Таблица 2 – Оценка специфичности ОТ-ПЦР для выявления респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота


Вирус (штамм, изолят)

Результаты ПЦР

Респираторно-синцитиальный вирус КРС (РСБ № 3)

+

Респираторно-синцитиальный вирус КРС (изолят К-18)

+

Вирус ПГ-3 КРС (ПТК)



Вирус ВД-БС КРС (ВК-1)



Вирус классической чумы свиней (вакцинный штамм)



Герпесвирус КРС 1-го типа (Оренбург)



Аденовирус КРС 1 типа (BV-10)



Риновирус КРС 1-го типа (SD-1)



Неинфицированная культура клеток Vero



Неинфицированная культура клеток ТЭБ



Примечание: «+» – положительный результат, «–» – отрицательный результат.


Из данных таблицы 2 видно, что при проведении ОТ-ПЦР на матрице РНК близкородственного вируса ПГ-3 КРС, вирусов вирусной диареи, классической чумы свиней, инфекционного ринотрахеита, адено- и риновирусов, а также – нуклеиновых кислот, выделенных из неинфицированных культур клеток Vero и ТЭБ, получены отрицательные результаты. Они подтверждают высокую специфичность реакции.


2.2.2.5. Влияние сроков хранения при различных температурных
режимах на пригодность РНК вируса к исследованию в ОТ-ПЦР


Результаты проведенных исследований показали, что хранение вируссодержащих суспензий при минус 18ºС обеспечивает сохранность материала, полученного из слизистой оболочки трахеи в течение двух месяцев, носовых выделений и бронхов – 4-х, бронхиального экссудата – 6-ти, а легких – 12 месяцев. Оптимальным режимом хранения выделенной РНК вируса является минус 18ºС в течение 2–10 месяцев, в зависимости от вида исследуемого материала. Наиболее пригодным материалом для исследований в ОТ-ПЦР являются пробы легких, бронхиального экссудата и бронхов.


2.2.3. Эффективность ОТ-ПЦР в производственных условиях

2.2.3.1. Частота выявления РНК вируса
из проб биоматериала от животных при вспышках
респираторных болезней


Целью данного раздела было изучение эффективности ОТ-ПЦР в производственных условиях при вспышках массовых респираторных болезней.

Результаты исследования представлены в таблице 3.


Таблица 3 – Результаты выявления вируса РСИ КРС методом ПЦР в пробах биоматериала различного происхождения




п/п

Вид биоматериала

Количество исследованных проб

Количество
положительных проб

Процент положительных проб от числа исследованных

1

Легкие

171

29

20

2

Лимфатические узлы

10

2

20

3

Носовые выделения

45

6

13,3

4

Экссудат из трахеи, бронхов, носовых синусов

24

11

45,8

5

Слизистая оболочка трахеи и бронхов

14

2

14,3

6

Бронхи

9

3

33,3

Всего:

273

51

19,4


Из данных таблицы 3 видно, что вирус чаще выявляли в пробах трахеального и бронхиального экссудатов (45,8%), бронхов (33,3%), легких и легочных лимфатических узлов (20%), слизистой трахеи и бронхов (14,3%), носовых выделений (13,3%) животных с наличием признаков острых респираторных болезней. Наиболее достоверное выявление генома вируса было при условии отбора проб биоматериала на ранних стадиях развития респираторных болезней и транспортировки их в лабораторию не дольше 24 часов с однократной заморозкой и оттаиванием, либо в контейнерах с транспортной средой в охлажденном виде.

2.2.3.2. Частота выявления РНК вируса у животных
различных половозрастных групп


Исследовали 66 проб, полученных от телят до 1 месячного возраста, 137 – от телят в возрасте от 1-го до 6-ти месяцев, 3 – от телок, 5 – от нетелей и 62 – от коров. Результаты исследований представлены в таблице 4.


Таблица 4 – Частота выявления РСВ КРС у животных различных половозрастных групп


Половозрастная группа

животных

Количество
исследованных проб
биоматериала

Выявлено
положительных проб

Процент положительных проб
от числа
исследованных

Телята от 10 дней до 1 месяца

66

3

4,5

Телята от 1 мес. до 6 мес.

137

27

19,7

Телки

3

0

0

Нетели

5

2

40,0

Коровы

62

10

16,1

Всего:

273

42

15,4


Из представленных данных видно, что наиболее часто вирус выявляли у телят до 6-месячного (19,7%), затем у коров при наличии признаков острых респираторных заболеваний, эмфизематозных поражений легких и интерстициальной бронхопневмонии (16,1%) и телят до 10-дневного возраста (4,5%), что свидетельствует об их восприимчивости к инфицированию вирусом.

Таким образом, к инфицированию вирусом восприимчивы все категории животных, однако его чаще выявляли у телят до 6-месячного возраста и коров. Наличие генома вируса в пробах биоматериала от телят до 10-дневного возраста свидетельствует, по нашему мнению, о вовлечении в эпизоотический процесс этой категории животных.

Вирус также обнаруживали у нетелей (40%). Однако незначительное количество проб биоматериала от них не позволяет достоверно судить о вовлечении этой категории животных в эпизоотический процесс.

2.2.3.3. Частота выявления генома РСВ КРС
и бактерий семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериала
от больных и инфицированных животных


Важным аспектом патогенеза болезни является подавление неспецифических механизмов иммунной защиты респираторного тракта, а также инициация и усиление бактериальной колонизации легких после первичного размножения возбудителя (A.F.S. Antonis et al., 2003; S.J. Fach et al., 2010). Вирус может вызывать бронхиты, пневмонии и эмфиземы легких самостоятельно, но главным его свойством является иммуносупрессия и формирование предрасположенности к возникновению бактериальных пневмоний, в частности, легочного пастереллеза (Э.А. Шегидевич, 1984; A.M. Al Darraji et al., 1982; L.A. Babiuk et al., 1988; L.E. Larsen et al., 1999; L. Liu et al., 1999).

Целью наших исследований было изучение частоты выявления вируса в ассоциации с бактериями семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериала от животных различных половозрастных групп при вспышках массовых респираторных болезней в хозяйствах региона Сибири. Диагноз на пастереллез подтверждался в лаборатории биотехнологии-диагностический центр, а также в Тюменской областной и Красноярской краевой ветеринарных лабораториях.

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Частота выявления РСВ КРС и бактерий семейства Pasteurellaceae в пробах биоматериала от животных

n = 273

Вид
возбудителя

Выявлено положительных проб/% выявления

Новосибирская область
(15 хозяйств)

Тюменская область
(9 хозяйств)

Красноярский край
(3 хозяйства)

РСВ КРС в моноварианте

40/14,7

25/9,2

14/5,1

1/0,4

Pasteurellacae:

Р. multocida

M. haemolytica

56/20,5

25 /9,2

31/11,4

31/11,3

21/7,7

10/3,7

18/6,6

4/1,5

14/5,1

7/2,6



7/2,6

РСВ + Pasteurellacae:

Р. multocida

M. haemolytica

27/9,9


9/3,3

18/6,6

5/1,8


2/0,7

3/1,1

21/7,7


6/2,2

15/5,5

1/0,4


1/0,4

Всего проб: 273

123/45,1

61/22,3

53/19,4

9/3,3


Из представленных данных видно, что РСВ КРС в моноварианте присутствовал в 40 (14,7%) пробах, полученных от больных животных из 27 хозяйств региона Сибири. Из них количество положительных проб составило по Новосибирской области 25 (9,2%), Тюменской области 14 (5,1%) и Красноярскому краю 1 (0,4%).

Выделение культур семейства Pasteurellacae в моноварианте составило 20,5% (56 проб), из них по Новосибирской области 11,3% (31 проба), Тюменской – 6,6 (18), Красноярскому краю – 2,6% (7 проб). Pasteurellae multocida присутствовала в 9,2% исследованных проб биоматериала, а Mannheimia haemolytica – 11,4%.

Выделение трех возбудителей в одной пробе биоматериала составило 9,9% от числа исследованных. Из них по Новосибирской области этот показатель составил 1,8%, Тюменской – 7,7 и Красноярскому краю – 0,4%.

Более высокая частота выделения бактерий семейства Pasteu­rellacae в моноварианте (20,5%), чем РСВ КРС (14,7%), на наш взгляд, связана с тем, что причиной возникновения вспышек «вторичного» пастереллеза в хозяйствах могли быть вирусы: прагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, а также другие факторы, понижающие резистентность респираторного тракта животных (стрессы, неудовлетворительные условия кормления и содержания животных).

Кроме этого большое значение может иметь несоблюдение правил отбора и транспортировки проб биоматериала в лабораторию, приводящее к инактивации вируса и получению ложноотрицательных результатов исследований. Поэтому истинную роль РСВ КРС в возникновении массовых вспышек респираторных болезней, в частности, пастереллеза крупного рогатого скота установить сложно.

2.2.3.4. Экономическая эффективность ОТ-ПЦР

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что ОТ-ПЦР, позволяет эффективно выявлять геном вируса в пробах биоматериала различного происхождения от больных и инфицированных животных.

В отличие от большинства вирусных инфекций выделение РСВ КРС в культурах клеток не является стандартной лабораторной процедурой. Поэтому ОТ-ПЦР наиболее пригодна для диагностики болезни.

В связи с этим целью настоящего раздела являлось определение экономической эффективности ОТ-ПЦР в сравнении с выделением вируса в культуре клеток, осуществляемым микрометодом.

Экономический анализ эффективности метода ПЦР в условиях диагностической лаборатории заключался в сравнительной оценке эффективности и требуемых денежных затрат на его проведение при сопоставлении с микрометодом выделения вируса в культуре клеток.

При подсчете принимали во внимание прямые затраты.

Составляющие прямых затрат при постановке ОТ-ПЦР:

1. расходы на синтез олигонуклеотидных праймеров (0,6 руб./10 проб);

2. расходы на приобретение набора для выделения РНК (180 руб./10 проб);

3. набор для проведения обратной транскрипции (ОТ) (180 руб./10 проб);

4. пластик (наконечники, пробирки типа Эппендорф, ПЦР-пробирки) 200 руб./10 проб;

5. tag-ДНК полимераза (17,5 руб./10 проб);

6. dNTP (15 руб./10 проб);

7. агароза для электрофореза (3 руб./10 проб);

8. буферный раствор (20 руб./10 проб);

9. затраты рабочего времени на постановку реакции на 10 проб – 4 часа;

10. заработная плата с начислениями основных исполнителей (старший научный сотрудник – 11160 руб./мес., лаборант-исследователь – 5196 руб./мес.).

При расчете брали 20 рабочих дней в мес., продолжительность работы – 8 часов. Итого 160 час.

11160 руб. за 160 час., а за 4 час. – 279 руб.

5196 руб. за 160 час., а за 4 час. – 129,9 руб.

Итого: 279 + 129,9 = 408,9 руб.

Сумма затрат на проведение исследований 10 проб составила:

0,6 + 180 + 180 + 200 + 17,5 + 15 + 3 + 20 + 408,9 = 1025 руб.

Составляющие прямых затрат при выделении вируса в культуре клеток:

1. расходы на приобретение питательных сред и растворов (Версена, глютамина, трипсина) – 3600 руб./10 проб;

2. расходы на приобретение эмбриональной сыворотки – 300 руб./10 проб;

3. пластик (культуральные матрасы, планшеты 24-луночные, наконечники, фильтры) – 150 руб./10 проб;

4. расходы на получение специфической гипериммунной сыворотки крови – 300 руб./10 проб;

5. расходы на приобретение жидкого азота – 10 руб./10 проб;

6. Затраты рабочего времени на исследование 10 проб биоматериала – 36 час.

7. заработная плата с начислениями основных исполнителей (старший научный сотрудник – 11160 руб./мес., лаборант-исследователь – 5196 руб./мес.).

При расчете брали 20 рабочих дней в мес., продолжительность работы – 8 часов. Итого 160 час.

11160 руб. за 160 час., а за 36 час. – 2511 руб.

5196 руб. за 160 час., а за 36 час. – 1169,1 руб.

Итого: 2511+1169,1 = 3680,1 руб.

Сумма затрат на проведение исследований 10 проб составила:

3600 + 300 + 150 + 300 + 10 + 3680,1 = 8040,1 руб.

Метод ОТ-ПЦР при диагностике РСИ КРС экономически эффективнее микрометода выделения вируса в культуре клеток (8040,1/ 1025) в 7,8 раза.

Данный метод дает возможность проведения анализа в течение 2 суток, а метод выделения вируса в культуре клеток занимает от 45 до 75 суток и более. Поэтому ОТ-ПЦР по срокам проведения в 22,5 – 37,5 раз быстрее.

Резюмируя полученные данные, можно сделать вывод, что разра­ботанная и апробированная нами ОТ-ПЦР с праймерами на ген гликопротеина F респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота
обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может эффективно использоваться в комплексе диагностических мероприятий, а также служить основным вирусологическим методом диагностики болезни у животных различных половозрастных групп.


3. ВЫВОДЫ

1. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота широко распространена в молочных хозяйствах Сибири и носит энзоотический характер. Серопозитивность животных к вирусу в среднем по трем административным территориям находилась в пределах 38,4–66,6%. У взрослого скота она достигала 76,3–86,7%, а у молодняка до 6 месяцев 20,4– 29,9%. В среднем у 54,3–92,6% телят до 30 дней отсутствовали колостральные антитела к вирусу. Титры антител у телят достоверно повышались к возрасту 12 месяцев и старше, свидетельствуя о переболевании в возрасте 4–10 месяцев.

2. Средние титры антител к вирусу у животных в хозяйствах с наличием импортированного скота были выше, чем у животных без него. В период вспышек болезни циркуляция вируса среди животных разных половозрастных групп происходила более активно, особенно среди нетелей, завезенных по импорту, и коров (нетели – 5,4±0,43 lg2; коровы – 5,1±0,02 lg2). При вспышках болезни сероконверсию к вирусу чаще выявляли у телят в возрасте 4–6 месяцев и коров (4 – 32 кратное повышение титров антител). Уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был более высоким (до 256-кратного).

3. Диагностическая ОТ-ПЦР с праймерами, комплементарными последовательностям высоко консервативного гена гликопротеина F РСВ КРС, обладала высокой чувствительностью и специфичностью. Она достоверно выявляла РНК исследованных штаммов вируса. В результате амплификации кДНК вируса синтезировался фрагмент 381 п.о. Чувствительность реакции составила 10–5 ТЦД50/мл. Выделенная РНК, используемая в качестве положительного контроля ОТ-ПЦР, сохраняла свою активность в течение 2–10 месяцев при минус 18ºС.

4. Методом ОТ-ПЦР установлено, что к инфицированию вирусом восприимчивы все половозрастные группы животных. В среднем вирус присутствовал в 15,4% исследованных проб биоматериала, полученных от крупного рогатого скота при вспышках болезни. Частота выявления генома вируса от телят до 6-месячного возраста составила 19,7%, а от коров 16,1% при наличии признаков острых респираторных заболеваний, эмфизематозных поражений легких и интерстициальной бронхопневмонии. Выявление генома вируса в 4,5% проб биоматериала от телят до 10-дневного возраста свидетельствовало о вовлечении их в эпизоотический процесс.

5. Вирус чаще выявляли в пробах трахеального и бронхиального экссудатов (45,8%), бронхов (33,3%), легких (20,0%), легочных лимфатических узлов (20,0%), слизистой трахеи и бронхов (14,3%), носовых выделений (13,3%) животных с наличием признаков острых респираторных болезней. Наиболее достоверное выявление генома вируса в пробах биоматериала происходило при их отборе на ранних стадиях развития респираторных болезней и транспортировке в лабораторию не дольше 24 часов с однократной заморозкой и оттаиванием, либо в контейнерах с транспортной средой в охлажденном виде.

6. РСВ КРС в моноварианте присутствовал в 14,6%, Pasteurella multocida – в 9,2, а Mannheimia haemolytica – в 11,4% проб биоматериала от больных животных. Одновременное выделение трех возбудителей в одной пробе было равным 9,9%.

7. ОТ-ПЦР экономически эффективнее микрометода выделения вируса в культуре клеток в 7,8 раза, а по срокам постановки в 22,5–37,5 раза. Время исследования 50 проб биоматериала составляло 48 часов, что по срокам постановки превосходило традиционный метод выделения вируса в 37,5 раз (45–75 суток и более).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В крупных хозяйствах молочного направления, неблагополучных по респираторным болезням крупного рогатого скота, необходимо проводить диагностические исследования с целью установления этиологической роли респираторно-синцитиального вируса согласно методическим рекомендациям «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденным подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 26.01.2010 г.);

2. Для диагностики болезни использовать «Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатогоскота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499) в комплексе с серологическими методами исследований.

5. Список работ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


1. Глотов, А.Г. Особенности эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах по производству молока / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, С.В. Котенева, А.В. Нефедченко, К.В. Войтова // Ветеринария. – 2010. – № 7. – С. 21–25.

2. Глотова, Т.И. Выделение и типирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого при помощи скота ОТ-ПЦР / Т.И. Глотова, О.В. Кунгурцева, А.Г. Глотов, И.Я. Строганова, К.В. Войтова, Т.В. Гальнбек // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. – 2010. – № 10 (214). – С. 59–64.

3. Строганова, И.Я. Методы обнаружения и идентификации респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток / И.Я. Строганова, К.В. Войтова // Вестник КрасГАУ. – 2011. – № 3. – С. 128–133.

4. Войтова, К.В. Распространение РСИ КРС в молочно-товарных хозяйствах / К.В. Войтова, А.В. Нефедченко, С.В. Котенева, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова, А.Г. Глотов// Научные основы производства биологических препаратов: материалы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию института (Щелково, 9–10 декабря, 2009), ВНИиТИБП – Щелково, 2009. – C. 242–245.

5. Глотов, А.Г. Выделение вируса респираторно-синцитиальной инфекции из проб биоматериала / А.Г. Глотов, К.В. Войтова, С.В. Котенева // Молодость, талант, знания агропромышленному комплексу России: материалы XIV междунар. науч.-практ. конф. молодых учёных и специалистов, посвящ. 80-летию академии: – Троицк, 2009. – С. 25–27.

6. Глотов, А.Г. Влияние условий хранения биоматериала на результаты ПЦР при респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, С.В. Котенева, К.В. Войтова // Актуальные вопросы ветеринарии: материалы II Сибирского ветеринарного конгресса (25–26 февраля 2010). – Новосибирск, 2010. – С. 311–312.

7. Войтова, К.В. Частота выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в пробах биоматериала от крупного рогатого скота методом ПЦР / К.В. Войтова, А.Г. Глотов // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учёных: тр. IV междунар. науч. конф. молодых учёных (пос. Краснообск 22–23 апреля 2010). – Новосибирск, 2010. – С. 34–37.

8. Глотов, А.Г. Особенности диагностики респираторных болезней крупного рогатого скота, вызываемых РНК-содержащими вирусами / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, К.В. Войтова, И.Я. Строганова // Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана: XIII междунар. науч.-практ. конф. (Улаанбаатар, 6–7 июня 2010). – Новосибирск, 2010. – С. 85–90.

9. Глотов, А.Г. Использование ПЦР для индикации респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, К.В. Войтова, И.Я. Строганова // Там же. – С. 91–93.

10. Войтова, К.В. Применение метода ПЦР для изучения распространения респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Сибири / К.В. Войтова, Т.И. Глотова, И.Я. Строганова, А.Г. Глотов // Молекулярная диагностика – 2010: VII Всеросс. науч.-практ. конф. с международным участием (24–26 ноября 2010). – Москва, 2010. – С. 79–80.


Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции iconСтроганова ирина яковлевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и особенности проявления болезни в современных условиях ведения животноводства

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции iconДиагностика ротавирусной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах омской области

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции iconУтвердить план оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза на 2011 год (приложение). Постановление подлежит официальному опубликованию
Ростовской области от 12. 05. 2005 №315-зс «Об областной целевой программе оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза на 2005...

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции iconРаспространение инфекционного ринотрахеита и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в центральной сибири

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции iconЛобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции icon«Лабораторная диагностика лейкоза крупного рогатого скота в лабораториях Ульяновской области за 2009 год». Уважаемые присутствующие!

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции iconОценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции icon13 марта 2001 г. N 9/15 об утверждении нормативных правовых актов по борьбе с губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота
Савета Рэспублiкi Беларусь, 1995 г., N 4 и в целях недопущения заноса на территорию Республики Беларусь губкообразной энцефалопатии...

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции iconПарагрипп крупного рогатого скота

Войтова ксения васильевна диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции iconПрофилактика лейкоза крупного рогатого скота

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU