В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных icon

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных





Скачать 283.24 Kb.
НазваниеВ настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных
Дата конвертации23.05.2013
Размер283.24 Kb.
ТипДокументы
В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных, на на­следственность.

Главные разделы биотехнологии — генная и клеточная ин­женерия. Методы генной инженерии наиболее детально разра­ботаны на микроорганизмах. Можно направленно изменять их генотип. В отличие от спонтанных мутаций эти изменения мож­но заранее планировать. Так, в микроорганизмы совершенно определенно встраивают гены, ответственные за синтез интер-ферона, соматотропина, некоторых незаменимых аминокислот. Возможности дальнейшего развития этого направления огром­ны. Широким фронтом ведутся исследования и разработки по выделению и клонированию определенных генов, их внедрению в геном. Если генная инженерия в микробиологии стала реаль­ностью и приобретает все большее практическое значение, то у животных применение этих методов только начинается, однако установлено, что в принципе можно выделить определенные гены из генома животных и встроить их в геном другой особи. Ген соматотропина (гормона роста) крысы встроен в геном мыши. В результате у некоторых трансгенных животных уве­личились скорость роста реципиента и конечная живая масса. Можно себе представить, какое огромное практическое значе­ние будет иметь использование этого приема на сельскохозяйст­венных животных. Представляется возможным по заранее на­меченному плану реконструировать геном домашних животных, придать ему заранее заданные свойства. Для достижения та­ких результатов традиционными методами потребовалась бы работа в течение многих поколений.

Возникает перспективная задача — использовать домашних животных как живые реакторы, ферментеры для производства ценнейших биологически активных веществ. Например, встроив ген интерферона с необходимыми регуляторными элементами в геном коровы, можно рассчитывать, что этот гормон будет экс-прессироваться и в молочной железе. А поскольку активность молочной железы высокая, то можно получать данное вещество с молоком в значительных количествах и, вероятно, при высокой экономической эффективности. Это же в принципе относится и к другим биологически активным веществам. В данном случае молочный скот — оптимальный объект для создания таких жи­вых реакторов. Ни одно другое сельскохозяйственное животное не имеет такого интенсивного синтеза самых разнообразных про­дуктов и выведения их из организма. Однако существующие методы введения в геном животных инородного генетического материала еще недостаточно совершенны и степень вероятности встраивания чужеродных генов и их экспрессии невелика и ис­числяется несколькими процентами и менее. Поэтому необходи­мо наличие большого числа яйцеклеток для успеха генно-инженерных манипуляций. Установлено, что оптимальной фазой вве­дения инородного генетического материала является стадия зи­готы до слияния пронуклеусов. Именно при введении генов в пронуклеус обеспечивается наибольшая вероятность успеха. Следовательно, необходимо иметь большое число яйцеклеток, и уметь их оплодотворять, чтобы уже на фазе зиготы подверг­нуть генно-инженерным манипуляциям. В принципе зиготы можно получать от предварительно стимулированных и оплодо­творенных животных оперативным путем. Но это очень сложный и трудоемкий способ, связанный с операциями на животных. Поэтому особое значение для развития генно-инженерных ра­бот в животноводстве приобретает отработка методов извлече­ния из яичников, культивирования, оплодотворения созревших овоцитов in vitro и последующего их раннего развития и транс­плантации. Сочетание этих двух методов создает оптимальные условия для широкого внедрения генной инженерии в практику селекционно-племенной работы в животноводстве. По всей ве­роятности, в ближайшей перспективе методами генной инжене­рии будут созданы новые формы сельскохозяйственных жи­вотных.

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ


Наряду с развитием методов генной инженерии в животно­водстве перспективны способы клеточной инженерии. В расте­ниеводстве в селекции эти методы уже получили значительное развитие. Культивирование клеток растений in vitro обеспечи­вает возможность применять системы интенсивного отбора кле­ток, культивированных в строго контролируемых селективных условиях.

Присущие растительным клеткам свойства тотипотентности (свойство отдельных клеток развиваться в целостный организм) дают возможность плюс-варианты регенерировать в целые рас­тения и использовать в процессе селекционной работы.

Методы клеточной инженерии перспективны и в животновод­стве. Уже накоплен большой опыт культивирования соматических клеток животных in vitro, разработаны оптимальные среды и режимы культивирования, отработаны способы длительного хранения клеток при низких температурах. Как уже было ска­зано, активные исследования проводятся и по культивированию генеративных клеток. Разработка этих методов создает прочную основу для развертывания теоретических и прикладных работ по клеточной инженерии сельскохозяйственных животных, ко­торые будут иметь все возрастающее народнохозяйственное зна­чение.

На первое место следует поставить уже достаточно хорошо разработанный метод разделения ранних эмбрионов. С развити­ем трансплантации в руках исследователей появилось достаточ­ное количество ранних эмбрионов, что дало мощный импульс работам по манипуляции с этими объектами. Первый успешный опыт по разделению эмбрионов на стадии 2—8 бластомеров был осуществлен Виллардом (Кембридж, Великобритания). Однако получение такого материала связано с большими трудностями и может быть осуществлено в научно-исследовательских учреж­дениях.

В результате исследователи начали манипулировать с эм­брионами в более поздних стадиях развития (морула, бласто-циста). Сущность метода заключается в том, что предваритель­но вскрывается прозрачная зона (pellucida), эмбрион разделя­ется на две части. При этом одна половина остается в прежней зоне, а другую переносят в заранее подготовленную зону и про­изводят обычную трансплантацию. Во многих опытах прижив-ляемость разделенных эмбрионов достигает 50—60%. Приклад­ной аспект этой методики заключается в увеличении числа те­лят, полученных от каждого донора. По данным американских исследователей, половинки эмбрионов, инкубировавшиеся без прозрачной оболочки, сохраняли жизнеспособность в культуре только в 15% случаев, а при наличии зоны пеллюцида — в 35% случаев. Наилучшие результаты были получены при нехирурги­ческом введении половинок эмбрионов — каждая в отдельной прозрачной оболочке в разные рога матки одного и того же ре­ципиента (55% стельности).

В другом опыте были достигнуты еще лучшие результаты при хирургическом введении каждой половинки эмбриона в рог матки на той стороне, где локализовалось желтое тело (65% стельности). Стало очевидным, что разделение эмбрионов — эф­фективный метод увеличения потомства коров-доноров.

В настоящее время эта методика начинает внедряться в практику племенного дела. Уже получены животные от транс­плантации половинок эмбрионов свиней (США, Р. У. Роунтри). По данным ряда исследователей, число потомков может быть увеличено на 30—35%. Однако этим не ограничивается значение клеточно-инженерной операции. Возможность массового получения идентичных двоен (генетических копий) очень важна. Эти животные имеют большую ценность для исследователей, зани­мающихся проблемой взаимодействия генотипа и среды. Ис­пользование идентичных двоен позволяет повысить точность исследований и достичь достоверных результатов при меньшем числе подопытных животных. Кроме того, наличие идентичных близнецов позволяет на одном из них проводить изучение при­знаков, требующих убоя животного (например, мясные качест­ва), и переносить эти данные на близнеца, что является мето­дически вполне обоснованным. Все это позволяет более точно и всесторонне оценить данный генотип. Кроме того, при трудо­емкой и длительной работе по оценке быков по качеству потом­ства эту работу можно проводить только с одним из двойневых идентичных быков. Оценка одного животного будет соответст­вовать оценке и другого идентичного животного. Имеется информация о том, что уже получено потомство при разделении бластоцисты на 4 части. Это еще в значительной мере увеличи­вает значение данного метода клеточной инженерии для повы­шения эффективности селекционно-племенной работы и исследований в области генетики сельскохозяйственных животных.

К важнейшим проблемам животноводства относится разра-ботка методов регулирования пола сельскохозяйственных жи­вотных. Непредсказуемость пола рождаемых животных может приобретать значительную важность, если экономическое зна­чение животных одного пола существенно выше экономического значения животных другого пола. Пока достигнут лишь незначительный прогресс в решении проблемы контролирования со­отношения полов и в разработке методов его регуляции. Иде­альным методом контролирования соотношения полов могло бы стать разделение спермиев, несущих Х- и У-хромосомы. Очевид­но, именно в этом направлении должны интенсивно развивать­ся исследования. Другим подходом для воздействия на соотно­шение полов является определение пола у ранних эмбрионов после извлечения из репродуктивного тракта самки и перед их трансплантацией.

Один из аспектов идентификации пола эмбрионов — цитоло­гический, с помощью которого определяют их тип (XX или XY) путем исследования половых хромосом или хроматина. Кроме того, иммуногенетические методы, используемые для идентифи­кации специфичных по полу антигенов эмбрионов, могут быть перспективны для разделения мужских и женских эмбрионов. Количественные различия в метаболической активности муж­ских и женских эмбрионов могут быть также использованы в качестве принципа для разделения эмбрионов по полу. Имеется сообщение, что с помощью колориметрического теста по опре­делению активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы можно идентифицировать пол. Перспективны методы, основанные на гибридизации ДНК для идентификации мужских эмбрионов. Каждый из указанных способов весьма перспективен. Однако в настоящее время наиболее разработаны и эффективны цито­логический и иммунологический методы.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ



Важнейшая народнохозяйственная задача — интенсифика­ция животноводства. Поставлена задача резко увеличить уро­вень производства продуктов животноводства при экономном расходовании ресурсов. Главный биологический фактор интен­сификации — генетическое совершенствование животных, основ­ных орудий производства в этой отрасли; повышение их генети­ческого потенциала. В результате планомерной, многолетней работы исследователей и практиков животноводства достигну­ты значительные результаты в селекции сельскохозяйственных животных.

Генетические методы все в большей степени находят приме­нение в селекционно-племенной работе. Особую роль в повыше­нии эффективности селекционно-племенной работы сыграло внедрение методов популяционной генетики. Разработка и при­менение методов определения изменчивости, повторяемости, на­следуемости и генетической корреляции количественных хозяй­ственно ценных признаков позволили точно прогнозировать и планировать селекцию на них. Популяционная генетика стала теоретической основой системы крупномасштабной селекции, которая интегрировала самые новейшие достижения в этой от­расли генетики, методы искусственного осеменения и длитель­ного хранения гамет сельскохозяйственных животных, а также современные способы сбора, хранения и анализа генетической информации с использованием современных ЭВМ.

Широкое использование крупномасштабной селекции преж­де всего в молочном скотоводстве, а затем и в других подотрас­лях животноводства позволило резко ускорить темпы генети­ческого совершенствования разводимых в стране пород сельско­хозяйственных животных. Возможности этой системы далеко не использованы, и она будет все шире внедряться в практику пле­менного дела.

Вместе с тем у этой системы, основанной на методах гене­тики популяций, имеются и ограничения. Так, поиск быка-улучшателя основан на оценке по потомству большого числа произ­водителей. А это связано с большими затратами, поскольку быки-улучшатели — явление редкое, а выдающиеся — чрезвы­чайно редкое. Кроме того, ряд селекционных программ, на­правленных на выведение животных, невосприимчивых к неко­торым заболеваниям (лейкоз, мастит), пока не дают сущест­венных сдвигов. Поэтому селекционеры сельскохозяйственных животных все чаще обращают внимание на клеточную и генную инженерию. Один из методов клеточной инженерии — транс­плантация ранних эмбрионов, получение идентичных близнецов, химерных животных — уже широко внедряется в практику се­лекции сельскохозяйственных животных и ускоряет генетическое улучшение пород.

С 50-х годов до настоящего времени разработаны методы генетического манипулирования, которые сложились в четкую систему генной инженерии животных. К этим работам относится пересадка клеточных ядер у лягушек методом микроинъекции Бригса и Кинга. В настоящее время перенос ядра соматической клетки в энуклеированную зиготу успешно проведен на мышах.

Освоен метод переноса ядра путем слияния кариопластов. Разработана методика получения химер у млекопитающих.

Гарднер разработал методику инъекции бластомеров в бластоцисты реципиента. Эта методика освоена на мышах Бутлером. На ее основании получены химеры у овец. Указанные рабо­ты, связанные с клеточной инженерией животных, подготовили подходы к генной инженерии сельскохозяйственных животных. Один из методов получения трансгенных животных заключает­ся в переносе генов в культивируемые клетки, а затем их инъ-ецировании в бластоцисту. Разработаны различные методы вне­сения генов в генотип реципиентных клеток.

Наибольшее распространение в последнее время получил метод инъецирования чужеродных генов в пронуклеус зиготы животных. Впервые инъецирование было проведено на ооцитах лягушек: в яйцеклетки вводили определенную ДНК, и были от­мечены интеграция и транскрипция.

В 1981 г. был инъецирован ген ^-глобина кролика в зиготу мыши. Ген, включенный в геном, имел вид длинного тандема организованных участков, которые корректно транскрибирова­лись только в том случае, если они не содержали плазмидных компонентов (Т. Е. Wagner и др.).

Проявление действия встроенных генов, введенных путем микроинъекции, изучали на мышах. На ряде генов установлено их тканеспецифическое действие в зависимости от регуляторных элементов того или иного гена.

В 1980 г. в пронуклеус зиготы мыши была инъецирована плазмида pBR322, содержащая вставку генов вирусов SK40 и HSV. У трех мышей (3,8%) из 78 найдена ДНК, что подтвер­дило хромосомную интеграцию, однако ДНК подверглась реор­ганизации.

При инъецировании гена -глобина человека в комплексе с геном ТК HSV в пронуклеусы зигот мыши установлена интегра­ция у пяти из 33 плодов (15,1%), извлеченных на 16—17-йдень.

Проведена микроинъекция в пронуклеус зиготы гена -гло­бина кролика, экспрессия наблюдалась у пяти мышей.

Бринстер и др. инъецировали в пронуклеусы зигот мышей комплекс, включающий металлотионеин мыши с геном тими-динкиназы с промотором, интеграция была отмечена у семи из 41 мыши (17%), экспрессия наблюдалась у четырех особей. Наиболее активная экспрессия отмечена в печени и почках.

Революционные достижения в биологии, особенно в генетике, позволили создать принципиально новые биотехнологии, генети­ческая инженерия стала признанной, перспективной техноло­гией.

В середине 70-х годов были открыты микробные ферменты, позволяющие разрезать молекулы ДНК в совершенно опреде­ленном месте, то есть выделять нужные ее участки, что позво­лило искусственно сливать гены или создавать рекомбинантную ДНК.

Стало возможным идентифицировать и клонировать опреде­ленные гены. Выбранный ген должен иметь какую-либо биоло­гическую функцию, которая может быть детектирована. Выделенный ген должен быть введен в ДНК-молекулу переносчика или вектора — посредника при переносе гена. Таким образом, ген может быть перенесен из организма донора в организм ре­ципиента, который впоследствии будет в состоянии реплициро­вать чужеродный ген. Следовательно, чужеродный ген в орга­низме реципиента будет не только действовать, но и реплици-роваться.

Генная инженерия в основном состоит из выделения из од­ного организма гена (ДНК), определяющего желательный при­знак, и переноса его в другой организм, который получает но­вый генетически наследуемый признак.

Современная биотехнология создает возможность передачи отдельного гена или блока генов, контролирующих определен­ный признак. Такой ген может быть перенесен из любого орга­низма в любой другой организм. При этом в новом организме он будет, вероятно, способен проявлять свойственную ему экс­прессию, то есть проявляться в фенотипе. При этом организмом-реципиентом может быть как растительная, так и животная форма.

Использование биотехнологии в селекции животных



Параллельно с генной инженерией разработан ряд других направлений биотехнологий. Одно из них — трансплантация оплодотворенных яйцеклеток и ранних эмбрионов. Этот метод успешно применяется в работе с крупным рогатым скотом на­чиная с 1951 г. Его используют для получения потомства от наиболее ценных животных.

Метод трансплантации эмбрионов стал одной из технологий генетической инженерии в работе с животными. Первым шагом в этом плане стала успешная трансплантация оплодотворенных яйцеклеток, в ядро которых был введен чужеродный ген путем микроинъекции.

Опыты на лабораторных животных быстро переросли в тех­нологии, практически применяемые уже на практике. Для полу­чения рекомбинантных продуктов используют бактерии, грибы и все чаще клетки животных. Это позволяет получать искусст­венным путем белки, которые в норме продуцируются только животными. Нужные гены были перенесены в соответствующие организмы, в которых и проявляли экспрессию .

Этот метод широко используется в медицине и ветеринарии. В качестве примера можно привести ренин, используемый в сы­роварении. Широки возможности получения таким путем и фер­ментов, используемых для изготовления моющих средств и в приготовлении пищи.

В настоящее время исследования направлены на создание системы ферментов для получения глюкозы из целлюлозы. Гены, контролирующие выделение ферментов, которые обнаружены у медленнорастущих грибов, были клонированы и перенесены в быстрорастущие бактерии и дрожжи. Это позволило создать эффективную технологию получения из целлюлозы древесины легкопереваримых углеводов. Проводятся работы по получению ферментов, участвующих в гидролизе лигнина, что позволяет создать технологию его расщепления на более простые молеку­лы, а это в дальнейшем даст возможность получать биогаз или одноклеточный протеин. Это может стать основой технологии обработки грубых, целлюлозсодержащих кормов (биомасса и т. д.).

Развернуты работы по получению трансгенных животных. Установлено, что мышь из трансплантированной яйцеклетки мо­жет иметь одну копию гена гормона роста или несколько таких копий в своих хромосомах. Гормон роста программируется ге­ном, стимулирует рост организма и определяет конечный его размер.

Гены, контролирующие образование гормона роста (как крысы, так и человека), уже изучены при введении в организм мыши. Все это указывает на реальную возможность использо­вания методов генной инженерии при работе с высшими живот­ными. Такая технология разрабатывается. При этом в первую очередь следует использовать гены, контролирующие интенсив­ный рост животных и эффективную их продуктивность. Иссле­дователи этой проблемы нередко сталкиваются и с нежелатель­ными последствиями введения чужеродного гена, в частности с потерей фертинга.

Генная и клеточная инженерия широко используются в вете­ринарии. Большие потери при воспроизводстве скота и птицы вызываются различными заболеваниями. Особенно большой ущерб наносят инфекционные заболевания. Для борьбы с ря­дом болезней успешно применяют различные вакцины. Метода­ми генной инженерии можно получить такие вакцины, которые невозможно получить традиционными методами. Эти вакцины могут быть более безопасными, дешевыми и стабильными по сравнению с существующими.

Иммунная реакция — мощный защитный механизм у живот­ных. При попадании в организм чужеродного белка определен­ные клетки продуцируют антитела, призванные нейтрализовать его. Установлено, что определенная часть молекулы протеина является антигенной детерминантой. При помощи рентгеногра­фии и кристаллографии можно не только увидеть структуру белка, но и установить локализацию антигенной детерминанты.

Возможность наблюдать трехмерную структуру антигенного сайта уже позволяет синтезировать полипептидную структуру, которая может служить в качестве синтетических антигенов для использования в вакцинации.

Гены, контролирующие образование таких полипептидных антигенов, могут быть синтезированы и введены в клетки, кото­рые будут в массе продуцировать антигены.

Важнейшая биотехнология для ветеринарии — гибридомная. Путем инъекции антиген вводят мыши. Клетки костного мозга мыши, продуцирующие антитела, сливаются (смешиваются) с клетками, способными расти в культуре (миеломные клетки). В результате гибридные клетки продуцируют антитела. Эти клетки можно клонировать. Клеточную линию, продуцирующую желательные антитела, от­бирают, и в постоянной культуре она становится источником антител. Этот метод используют для идентификации антигенных белков, а также специфических антигенных сайтов, определяю­щих образование антител.

В настоящее время эти технологии получают все большее развитие.

Развитие методов биотехнологии животных


В отношении сложнообусловленных полигенных количест­венных признаков, к которым относятся большинство хозяйст­венно ценных показателей сельскохозяйственных животных,, в селекции применяются методы популяционной генетики.

Методы определения изменчивости, повторяемости, наследуе­мости количественных признаков, генетических корреляций между ними положены в основу современной крупномасштаб­ной селекции.

Все это дает возможность точно планировать селекционно-племенную работу по улучшению количественных признаков.

Широкое использование информатики и ЭВМ позволяет создать базу для оперативного анализа генетической информа­ции в огромных по численности популяциях сельскохозяйствен­ных животных. Все это значительно ускоряет темпы генетиче­ского улучшения разводимых в стране пород, активизирует про­цессы выведения новых линий, типов и пород животных.

Генная инженерия представляет собой логическое продол­жение развития и применения новейших генетических методов в селекции животных. Возможности генной инженерии увеличи­лись в связи с открытиями в области регулирования действия генов. Инъекция клонированного гена ростового гормона чело­века свиньям и овцам стала возможной в результате двух но­вых методов биотехнологии — микрохирургии на эмбрионах и рекомбинации ДНК. Микрохирургия на яйцеклетках и эмбрио­нах и рекомбинация ДНК в принципе открывают возможность более интенсивной селекции животных. Сочетание генетического манипулирования с уже широко распространенными методами / длительного хранения спермы и эмбрионов дает селекционеру/ невиданные возможности более эффективной селекции.

Основные методы генной инженерии животных



Успех генной инженерии на животных зависит от возможности вставок генов (представляющих интерес) в геном. Два ме­тода открывают большие возможности для вставки клониро­ванных генов в ядро клетки: перенос генов в пронуклеус и ви­русная трансфекция.

Перенос генов с ДНК- Установлено, что инфекционность ДНК аденовируса 5 в однослойной культуре клеток KB челове­ка может быть значительно повышена путем преципитации ви­русной ДНК с помощью фосфата кальция.

Метод оказался эффективным и для других ДНК. Исполь­зуя перенос генов с помощью ДНК, Виглер и другие смогли пе­ренести ДНК, включающую ген тимидинкиназы (ТК), выделен­ный из вируса герпеса (HSV-1) в культивированные клетки мыши, в которых тимидинкиназа отсутствует. Полученные в ре­зультате этого клоны, содержащие вирусную тимидинкиназу, стабильно поддерживались в течение ряда поколений. По­скольку эффективность трансфекции ДНК с фосфатом кальция невелика, то для отбора клонов клеток, трансформированных по тимидинкиназе, была использована среда HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клетки, не прошедшие трансформа­цию, не имели ТК, поэтому после трансформации их можно было элиминировать (отбросить) и культивировать в среде, содержащей HAT. Выжили только клоны с функциональной ти-мидинкиназой. Для селекции можно использовать свойство ус­тойчивости к определенным веществам, например неомицину.

Вирусная инфекция. Вирусная инфекция — естественный путь введения генетической информации в клетки (животных). Кро­ме того, вирусы используются для трансформации клеток с ценными генами. Проведена работа по инъекции ДНК вируса 5V40 в бластоцель мышиных эмбрионов и пересадке трансфор­мированных эмбрионов в матку псевдобеременных мышей. Эта ДНК обнаружена у 25 из 29 мышей, полученных из 80 инъеци­рованных эмбрионов. Анализ на гибридную ДНК показал, что 10 мышей были носителями ДНК вируса SVO. Вирусная ДНК была неравномерно распределена по тканям, вероятно, в связи с неодинаковым уровнем инфицирования клеток внутренней клеточной массы или в результате гибели некоторых линий эмбриональных клеток, несущих вирус, в процессе развития.

Показано, что мыши, зараженные вирусом лейкемии Молони на стадии 4—8 клеток, стабильно содержали одну копию вируса в своем геноме. Вирус передавался потомству как менделевский доминантный признак. Мыши II поколения были заражены и поражались лейкемией. Проявление вируса у взрослых живот­ных варьировало: у некоторых линий мышей развивалась ран­няя лейкемия, а у других заболевание развивалось в более позднем возрасте.

Одно из возможных последствий внедрения гена с примене­нием любых способов — образование вставочных мутаций, то есть изменений в функции собственного гена в результате вста­вок чужого гена в него или около него. Одна линия мышей, трансформированных вирусом лейкемии Молони, не могла быть доведена до гомозиготности. В результате ранней эмбриональ­ной смертности гомозиготных эмбрионов продукт полного доми­нирования гена в процессе развития отсутствовал.

Получение мутантов путем вставок открывает огромные воз­можности для генетических исследований.

Данные об использовании ретровируса для трансформации клеточных линий млекопитающих по функционально неселекти­руемому гену в литературе не встречаются. Однако Миллер и другие описали синтез поддающегося селекции ретровируса, содержащего миниген, контролирующий ростовой гормон кры­сы, который может инфицировать культивируемые клетки и обусловливать выработку большого количества ростового гор­мона. Вставка вирусов в клеточный геном происходит в одном месте без перестройки. Было установлено, что изменение харак­тера проявления действия гена обусловлено первоначальным ме­стом его встройки, а не последующей модификацией.

В настоящее время разработаны системы различных ретро-вирусных векторов, обеспечивающие надежные трансфекции чужеродных генов в организм птиц и млекопитающих.

Таким образом, с учетом сложности генома животных, а так­же наличия взаимодействия генов в ряде случаев эффект встав­ки гена будет проявляться не в чистом виде, а сопровождаться другим, иногда не контролируемым пока изменением генома.

По-видимому, огромную роль здесь может играть и так на­зываемый эффект положения гена, то есть воздействие внедрен­ного гена будет во многом зависеть от его локализации в гено­ме реципиента.

Имеются данные о том, что вирусы саркомы Молони у мы­шей могут быть использованы для инфицирования клеток эм­бриональной карциномы, которые способны к самостоятельно­му размножению, как и клетки эндодермы эмбрионов мышей» в результате чего вирус, находившийся в клетках в большом числе копий, не проявлял своего действия вследствие метилирования. Однако, если ДНК вводилась в дифференцированную , клетку, действие гена проявлялось.

Существуют и другие, не вирусные, элементы, которые мо­гут служить носителями при переносе генов. Это так называе­мые мобильные элементы. В 1983 г. была изолирована и описа­на ДНК мобильных Р-элементов из дрозофилы. Эти элементы иногда образуют вставки в геноме дрозофилы. Они могут быть вырезаны с большой точностью, после чего мутировавший в результате вставки ген снова начинает проявлять свое действие. При инъекции ДНК предполагаемого Р-элемента задней сторо­ны яиц мух типа М перед самым образованием полярных кле­ток отмечалась высокая степень мутабельности в отдельном локусе, который контролирует морфологию волосков и щетинок на кутикуле взрослых мух. Появление мутантных линий мож­но было демонстрировать гибридизацией in situ, при которой проявлялось включение ДНК Р-элемента. Включенные в геном Р-элементы не содержали ДНК дрозофилы, которая присутство­вала в оригинальном гибридном материале или в участке плазмиды-носителя pBR 322, что доказывает транспозицию элемен­та Р в геном. Затем Рубин и Спрадлинг осуществили соедине­ние гена, контролирующего ксантиндегидрогеназу, и инъециро­вали эту конструкцию в эмбрионы. Взрослые мухи передали своему потомству признак розовой окраски глаз, и таким обра­зом была доказана наследуемость гена. Ученые предложили две модификации ДНК элемента Р для того, чтобы сделать его бо­лее пригодным в качестве носителя: включение большого числа сайтов рестрикции в этот элемент и создание аномального Р-элемента, кодирующего транспозазу, но не включаемого в геном. Р-Элементы были использованы для вставки»различных генов в геном дрозофилы, в частности, допа-декарбоксилазы и спиртовой дегидрогеназы. Оба гена проявляли свое действие на соответствующих стадиях развития, причем в тех тканях, в ко­торых этот ген обычно проявляется.

Наиболее широко для введения генов используется микро­инъекция. Весьма совершенным методом, используемым в по­следнее время для изучения проявления действия генов, явля­ется микроинъецирование в пронуклеус зиготы. Впервые инъецирование было проведено на ооцитах лягушки Xenopus lae­vis, в которые вводили хорошо известную ДНК. В 1975 г. Кол-ман ввел в яйцеклетки и ооциты X. laevis ДНК клонированные гены и наблюдал проявление их действия, чтобы изучить, при­сутствует ли механизм переноса и в ооцитах, и в яйцеклетках. Установлено, что транскрипция рекомбинантной ДНК происхо­дила в обоих случаях. Было показано, что ооциты X. laevis мо­гут транскрибировать рекомбинантные ДНК вполне эффективно, если ДНК вводится в зародышевый пузырек. В 1981 г. осу­ществлено инъецирование гена -глобина кролика в оплодотворенные яйцеклетки X.Laevis.

Генная инженерия и воспроизводство животных



К важнейшим хозяйственно ценным признакам сельскохозяйственных животных относятся воспроизводительная способ­ность, плодовитость.

Совершенно очевидно, что эти процессы находятся под стро­гим генетическим контролем, который осуществляет гормональ­ный статус организма, непосредственно влияющий на показа­тели воспроизводства. Установлено влияние ряда гормонов (ФСГ и ЛГ) на функцию воспроизводства.

Стало принципиально возможным методами генной инжене­рии организовать биотехнологическое производство этих гормо­нов для регуляции и стимуляции функций воспроизводства, осуществления работы по трансплантации ранних эмбрионов. В этой связи представляет интерес изучение гена овец по­роды бурула, который является геном, прямо влияющим на функцию яичника овцы.

Бурула — одна из небольшого числа мериносовых пород овец, с высокой генетической обусловленной способностью к высокой плодовитости. Порода представляет большую ценность в качестве генетического улучшателя (путем скрещивания) овец других мериносовых пород в отношении увеличения (40— 60%) их плодовитости. При традиционной внутрипородной се­лекции по этому признаку такой эффективности можно достичь примерно в течение 30 лет.

Плодовитость овец относится к полигенным признакам, на которые оказывают влияние многие гены.

Высокая плодовитость овец бурула — вероятно, следствие влияния одного гена (F), который воздействует на число овулируемых яйцеклеток из яичника за каждый цикл течки. Этот факт возродил интерес к изучению роли основных генов (оли-гогенов) в развитии количественных признаков животных и к развитию методов их распознавания и использования.

Животные — носители бурулагена — уже были использова­ны для генетического улучшения эффективности воспроизвод­ства овец. Ген F ввели в геном животных других пород овец путем скрещивания и разработали точные математические мо­дели для прогноза возможной эффективности этих программ. Технология рекомбинантной ДНК во многом может упростить этот процесс и сделать возможным пересадку гена F не толь­ко в геном овец, но и других видов сельскохозяйственных жи­вотных. Поэтому обзор данных о бурулагене представляет большой интерес для практической генной инженерии сельско­хозяйственных животных.

Изучение межлинейных кроссов показало, что повышение плодовитости — результат скрещивания бурула с другими ме­риносами, а также с различными другими породами овец. Од­нако не всегда повышение плодовитости можно отнести к эф­фекту только одного гена.

Из многих работ, посвященных оценке сравнительной про­дуктивности помесей бурула с овцами других пород, только п одной выявлен эффект F-гена на шерстную продуктивность и живую массу тела. В этой работе было показано, что ген не оказывает нежелательных плейотропных действий на настриг шерсти, толщину и длину волокна, массу новорожденных яг­нят, живую массу взрослых (15-месячных) овец. Эти данные подтверждают, что принципиальный эффект гена — влияние на плодовитость в результате воздействия на степень овуля­ции, в частности число потомков овец с генотипом FF, — был в 1,9 раза больше.

Исследования биологии размножения овец бурула подтвер­дили, что роль F-reiia направлена на контроль физиологии яич­ника овец. Установлено, что овцы бурула имеют одинаковое с контрольными мериносами число развивающихся фолликулов. У овец романовской породы в 2 раза больше развивающихся фолликулов, чем у овец других пород. В пределах популяции

бурула (степень овуляции от 3 до 9) не было корреляции между степенью овуляции в предшествующем цикле и числом антральных фолликулов.

Эти данные подтверждают, что яичник овцы бурула имеет отличие в фолликулярных характеристиках от других плодо­витых пород. Стало очевидно, что F-ген не влияет на увеличе­ние числа развивающихся в яичнике фолликулов. Степень ат-резии среди развивающихся фолликулов также влияет на сходство овец с -геном и не несущих его.

Однако овцы породы бурула характеризуются наличием фолликулов, которые имеют значительно меньшие размеры к моменту овуляции, а также тем, что они содержат только 50% числа гранулированных клеток в каждом развивающемся фол­ликуле; эти морфологические признаки" могут быть отнесены непосредственно к эффекту F-гена.

Различия в развитии и морфологии фолликулов в такой же степени, по-видимому, обусловливают высокую степень овуля­ции у бурула. Было отмечено, что у бурула фолликулы диа­метром менее 2 мм появлялись между 13-м и 15-м днями цик­ла и они достигали овуляционного размера (3—4 мм) на 15-й день. Однако пополнение продолжалось в течение 15—17 дней, и дополнительные фолликулы у бурула достигали овуляцион­ного размера ко времени высвобождения лютеинизирующего гормона (ЛГ). Этого явления не отмечали у романовской по­роды, и оно характерно только для овец породы бурула.

Таким образом, два генотипа мериносов (то есть бурулаи контроль) начинали лютеолизис с небольшим числом кандида­тов (то есть антральных фолликулов) для овуляции. У конт­рольных мериносов часть «доминантных» фолликулов быстро развиваются, а остальные прекращают развитие и атрезируют. У бурулы дополнительные кандидаты не исключаются, и их развитие до конечной стадии роста фолликулов и овуляции индуцируется повышенной частотой выброса ЛГ.

Время предовуляторного высвобождения ЛГ у плодовитых овец — важный признак. В исследованиях на плодовитых ов­цах с генотипами, отличающимися от генотипа бурула, было по­казано, что у них высвобождение ЛГ отмечалось значительно позже после начала течки (и лютеолизиса), чем у овец с низ­кой плодовитостью. У овец бурула этого не происходит, так как оба генотипа и «С»-мериносы высвобождали ЛГ прибли­зительно через 4, 5 ч после начала течки. У овец бурула ову­ляция отмечается в среднем на 7,5 ч раньше после начала теч­ки по сравнению с контролем, несмотря на одинаковое время высвобождения ЛГ. Ген F, по-видимому, делает предовуляци-онные фолликулы более чувствительными к эндогенному ЛГ.

Имеются данные, свидетельствующие о том, что овцы буру­ла, не достигшие половой зрелости, и взрослые имеют в плазме более высокие концентрации ФСГ, чем контрольные мериносы. Это различие было также подтверждено в отношении гипофиза с помощью метода радиорецептора и радиоиммунного теста.

Можно заключить, что множественная овуляция у овец — результат интенсивной ФСГ-стимуляции яичника в течение поздней лютеиновой и ранней фолликулярной фаз цикла течки.

Активность яичника овцы бурула, вероятно, не зависит от концентрации гонадотропина в плазме, а связана с повышен­ной чувствительностью к гонадотропину фолликулов этих жи­вотных. Это утверждение основано на том, что овца бурула проявляет более высокий овуляторный ответ на гонадотропин СЖК (ГСЖК), чем мериносы, и что овцы с F-геном более чув­ствительны к ГСЖК, чем овцы без F-гена. Различие в чувстви­тельности было явным начиная с 5-месячного возраста овец. Это может быть основным признаком генотипов плодовитых животных, поскольку генетические связи между плодовитостью и чувствительностью к ГСЖК описаны также у мышей и круп­ного рогатого скота.

Пока не установлено — яичник или индивидуальные фолли­кулы плодовитых пород более чувствительны к ФСГ — гормо­ну, отличающемуся от экзогенного ГСЖК. Такие данные могут быть получены, при исследовании ответа изолированных фол­ликулов на добавление ФСГ или ответа яичника гипофизэкто-мированных овец на введенный овечий ФСГ. Такие экспери­менты проводятся.

Если фолликулы овцы бурула имеют больше рецепторов к гонадотропину, то они могут затем больше захватывать гона­дотропина из циркулирующей крови, чем фолликулы других мериносов. Этим можно объяснить различия в чувствительнос­ти яичника между генотипами. Приобретение рецепторов к ЛГ на гранулированной оболочке — существенная необходимость для овуляции развивающихся фолликулов овцы. У овец финс­кий ландрас таких фолликулов в фолликулярную фазу боль­ше, чем у овец породы суффольк. Однако нет данных, что пло­довитая овца имеет больше рецепторов к ЛГ на каждом фол­ликуле.

Можно предположить, что добавочные фолликулы, которые развиваются у овец бурула, образованы так в результате нали­чия у них рецепторов к ФСГ (или большого числа рецепторов к ФСГ), что делает их способными отвечать на этот гонадотро­пин.

Было сделано заключение, что фактор яичника, отличный от эстрадиола и прогестерона, должен способствовать регуля­ции обратной связи ФСГ в течение цикла течки у овец. Фактор яичника,— по-видимому, ингибин, нестероидный гонадный гормон, способный селективно угнетать выделение ФСГ из ги­пофиза. Несмотря на то что в настоящее время ингибин очищен, данные о его влиянии на плодовитость основаны главным образом на экспериментах с использованием фолликулярной жидкости (ФЖ), свободной от стероидов. Установлено, что в ФЖ имеются другие белковые гормоны, которые могут непо­средственно действовать на яичник.

Свободная от стероидов овечья ФЖ способна подавлять течку и овуляцию у бурула и мериносов. Повторяющиеся инъ­екции овечьей ФЖ в течение 5 дней задерживают овуляцию, по крайней мере, на 12 дней. Частично очищенная овечья ФЖ была эффективна в такой же степени, как и неочищенная ове­чья ФЖ в подавлении овуляции. Этот эффект, по всей вероят­ности, результат действия ингибина в овечьей ФЖ, поскольку последняя селективно подавляет ФСГ у овцы.

Доказательство включения ингибина в действие /-'-гена по­лучено путем измерений его биоактивности у овец бурула и мериносов.

У овец бурула. со средней степенью овуляции 2,8 содержа­лось '/з ингибина по сравнению с мериносами, у которых было в среднем 1,2 овуляции.

Изучение ингибина в яичнике бурула позволило определить связь между этим гормоном яичника и плодовитостью. Кос­венно эта связь доказывается повышением степени овуляции, которое отмечается у мериносов после активной иммунизации против ингибина. Это было впервые описано у мериносов в 1982 г. и затем подтверждено "в исследованиях на овцах дру­гой породы.

Наблюдалось достаточно эффективное повышение степени овуляции у иммунизированных животных. У них выявляли по­терю регуляторного контроля функции яичника, которая про­ходила по такому же пути, как и у бурула. Так, ягнята-мери­носы, иммунизированные против ФЖ крупного рогатого скота с третьей недели жизни, раньше достигали половой зрелости, и у них повышалось число овуляций (до 8).

Следовательно, недостаток ипгибина яичника может иметь ключевое значение в высокой степени овуляции у бурула, опо­средованной, вероятно, с помощью повышенной концентрации ФСГ в течение течки. Наличие изменений в фолликулах буру­ла, включая снижение популяции гранулированных клеток, со­гласуется с недостатком ингибина, местом синтеза которого яв­ляются эти клетки. Ускорение полового созревания и повыше­ние степени овуляции у нормальных мериносов, иммунизиро­ванных против богатой ингибином фракции ФЖ крупного ро­гатого скота, — дополнительные косвенные доказательства этой гипотезы.

Хотя ингибин — белок яичника, селективно регулирующий секрецию ФСГ с помощью влияния по принципу обратной свя­зи на систему гипоталамус — гипофиз, имеются веские основа-

кия предполагать о наличии интраовариалыюго регулирующего вещества, которое может включаться в процессы овогенеза. Было показано, что свободная от стероидов фолликулярная жидкость содержит вещество (фактор, ингибирующий разви­тие фолликула), которое ингибировало фолликулярный ответ у хронически гипофизэктомированных овец на введение 2250 ME ГСЖК. Этот ингибитор роста фолликулов не мог быть ипгибином, но, вероятно, оказывал местное воздействие внутри фолликула яичника, прерывая митотическое деление гранулированных клеток.

Указанное предположение позволяет объяснить, как у овец основные, или доминантные фолликулы среди фолликулов — кандидатов для овуляции — могут секретировать вещество, ко­торое локально подавляет развитие других кандидатов. Наи­более важная задача — установить, имеет ли яичник овец бурула такой же дефицит ингибитора развития фолликулов, как и для ингибина.

Возможно, у овец имеется развитая двойная система регу­лирования. Таким образом, у овец всех пород наступает фол­ликулярная фаза нового цикла течки с избытком фолликулов, способных овулировать (суперовуляция у некоторых овец, под­твержденная с помощью ГСЖК или ФСГ). После лютеолизиса у нормальной овцы, когда начинается развитие фолликулов, | продукция ингибина снижает обеспечение ФСГ в такой степе­ни, что новые фолликулы не могут начать развитие. В это же время, в качестве гарантированного предупреждения развития доминантные фолликулы продуцируют ингибитор роста фолли­кулов, который исключает возможность начать развитие допол­нительных фолликулов с помощью деления гранулированных клеток. При этом также должно обеспечиваться сохранение уровня продуцируемого ФСГ для дополнительных фолликулов.

Периферические концентрации эстрадиола незначительно отличаются у овец бурула и мериносов в течение цикла течки. Концентрации эстрадиола в кровеносных сосудах яичника аналогичны таковым у овец, имеющих -ген, так и не имею­щих его. Очевидно, особые фолликулы, которые полностью раз­виваются и овулируют у овец бурула, не секретируют допол­нительный эстроген. Возникло предположение, что различие в чувствительности к отрицательной обратной связи, обусловлен­ной стероидами, может быть ответственным за высокую сте­пень овуляции у плодовитых овец финский ландрас. Установ­лено, что при угнетении отрицательной обратной связи ЛГ с помощью эстрадиола у овариэктомированных овец бурула и мериносов оба генотипа имели одинаковую .чувствительность.

Особенность лютеиповой функции у овец бурула заключа­ется в том, что концентрации прогестерона в плазме на 9—11-й день с начала течки не повышаются с увеличением степени овуляции, что резко контрастирует с тем явлением, когда степень овуляции повышалась с помощью ГСЖК. Основа этого явления неизвестна, хотя, по-видимому, это результат понижен­ной массы индивидуального желтого тела у овец бурула.

Бурула-мериносы — наиболее интересная генетическая мо­дель плодовитости у овец. Приведенные данные показывают, что эти животные имеют уникальный генотип. Практическое значение F-reiia заключается в значительном его действии на плодовитость. Поэтому он может быть использован для быст­рого повышения у овец эффективности воспроизводства. Дей­ствие копии гена сравнимо с эффектом многолетней внутрипородной селекции на величину приплода или степень овуляции.

Открытый ген F бурула в принципе может быть выделен, клонирован и введен в геном других сельскохозяйственных жи­вотных, что позволит существенным образом улучшить их вос­производительную способность. Перспективно также выделение генов, определяющих синтез ряда гормонов, связанных с регуляцией процессов воспроизводства, и введение их в геном жи­вотных.

Следовательно, и в этой области генной инженерии открываются большие перспективы для селекции сельскохозяйственных животных.


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


  1. Троицкий Н.А., Картель «Генная инженерия», Минск,1980.

  2. Эрнст Л.К. , Сергеев Н.И. «Трансплантация эмбрионов с/х животных», М.,1989.

  3. Красота В.Ф. «Разведение с/х животных «, М.,1990.







Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconРекомендации по применению эффективных методов лечения и профилактики акушерско-гинекологической патологии у коров Витебск 2013

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconОстропротекающее вирусное заболевание животных и человека, поражающее центральную нервную систему. Бешенство известно с древнейших времен, в настоящее время вс

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconПрофессиональные болезни это группа заболеваний, возникающих исключительно или преимущественно в результате воздействия на организм неблагоприятных условий тр

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconЗадачи курса получение фундаментальных знаний в области методов прикладной бактериологии, вирусологии, серологической лабораторной диагностики. Согласно требованиям квалификационной характеристики

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconИнтервью с Ю. П. Трутневым То, о чем так долго говорили специалисты, свершилось: госполитика и регулирование в сфере охраны, изучения, сохранения, воспроизводства и использования объектов животного мира,
Желаем Вам, Камиль Фарухшинович, благополучия, стабильности, здоровья, успехов в работе, взаимопонимания в семье, счастья, новых...

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconДоктор философских наук, профессор, заместитель председателя рнкб б. Г. Юдин Доклад подготовлен при финансовой поддержке Фонда фундаментальных исследований Р

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconВ настоящее время большое внимание в публикациях уделяется кремам, маскам, шампуням с особыми компонентами, которые из вне поддерживают нормальное состояние сло

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconКоличество химических соединений, используемых в настоящее время в народном хозяйстве и быту, настолько велико, а характер их биологического действия настолько

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconВозбудитель сальмонеллы (свыше 2000 видов и каждый год обнаруживают 40-60 новых). Ис­точник инфекции в основном животные; од­нако в последнее время виновни

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных iconГематол и трансфузиол., 2005, т. 50, №3 © А. В. Терлецкий, Л. Г. Ахмерова, 2005
Отмече­но, что это кровепаразитарное заболевание сопровождается широким спектром патологических изменений в органах и тканях. Указано...

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU