Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота icon

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота





Скачать 230.2 Kb.
НазваниеУдк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота
Дата конвертации23.05.2013
Размер230.2 Kb.
ТипДокументы
УДК 619:616.98.578.828.11Л


СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНЗООТИЧЕСКОГО ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА


К.Н. Мукантаев, К.К. Муканов, А.В. Шустов, К. Турсунов, Ш. Байдосова


РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК, г. Астана

e-mail: lii@biocenter.kz


В обзоре представлены общие сведения о вирусе лейкоза крупного рогатого скота, описан процесс синтеза провирусной ДНК и встраивание его в хромосому клетки. Представлен сравнительный анализ различных вариантов иммуноферментного анализа, разработанных для диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота. Дан сравнительный анализ методов получения рекомбинантных антигенов вируса и синтетических пептидов, мимикрирующих важные диагностические эпитопы вируса.


Введение


Лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС) - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, в большинстве случаев протекает бессимптомно, примерно у 30% зараженных животных в течение 3 лет проявляются персистентным лимфоцитозом, образованием опухолей в кроветворных и других органах и тканях.

Анализ литературных источников показывает, что заболевание наносит значительный экономический ущерб, представляя угрозу исчезновения генофонда основных ценных высокопродуктивных пород крупного рогатого скота. Несмотря на проводимые мероприятия по оздоровлению хозяйствующих субъектов от этой болезни, в республике сохраняется высокий уровень пораженности стад ЛКРС. На долю Северного Казахстана приходится 39,4% неблагополучных пунктов, 53,6% заболевших и 81,5% павших от ЛКРС. По данным этого же автора, инфицированность коров в 7 хозяйствах Алматинской области колебалась в пределах 14,5-75,2%.

Во всех странах мира в искоренении данной болезни особое место отводится современным методам диагностики, поскольку средства специфической профилактики еще не разработаны. Для диагностики лейкоза были разработаны свыше 20 различных серологических тест-систем, основанных на выявлении специфичных к вирусу антител (РИД, РСК, РДСК, ИФА, РИФ и др.). Зараженных животных можно выявить прямым и косвенным методом. Последний основан на выявление антител к вирусу в реакции иммунодиффузии (РИД), иммуноферментным методом (ИФА, ELISA). Золотым стандартом при диагностике инфекционных болезней является метод прямого выявления возбудителя. Однако данный метод выявления вируса многозатратен, требует специальной подготовки и не осуществим при массовых исследованиях.

В связи с этим, остро встает вопрос о необходимости разработки высокочувствительных методов диагностики, основанных на современных достижениях биотехнологии и внедрения отечественных технологий по их производству с последующей коммерциализацией.


Общие сведения о вирусе лейкоза крупного рогатого скота


Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является возбудителем энзоотического лейкоза, злокачественной болезни лимфатической системы [1]. Вирус относится к семейству Retroviridae, подсемейству Oncoviridae типа С. По своей морфологии вирус сходен с возбудителями лейкоза других видов животных. Представителями данного семейства являются вирусы саркомы и лейкоза кошек, павианов, гиббонов и шерстистых обезьян, Т-лимфоцитарные вирусы человека. Вирионы ретровирусов содержат липидную оболочку, окружающую икосаэдрический капсид, который в свою очередь окружает спиральный нуклеокапсид. Вирусы имеют семь полипептидов, при этом поверхностные гликопротеины (env) содержат типоспецифические эпитопы, а внутренние белки (gag) несут перекрестно-реактивные эпитопы.

Во внешней среде вирус малоустойчив. При нагревании до 60°С вирус погибает в течение минуты, чувствителен к действию растворов едкого натрия, формальдегида и других дезинфицирующих веществ в общепринятых концентрациях. Однако, в клетке, в связанном с ее геномом состоянии вирусы могут находиться длительное время. Патогенное действие он проявляет при снижении обменных процессов и иммунологической реактивности организма животных.

Проникновение вириона в цитоплазму клеток осуществляется путем эндоцитоза. Связывание вирионов со специфическими клеточными рецепторами происходит с помощью поверхностных гликопротеинов вируса, на поверхности которого расположен участок связывания с данными рецепторами. Взаимодействие рецептора с поверхностным гликопротеином вызывают конформационные изменения в трансмембранном гликопротеине вируса, приводящие к слиянию мембраны вириона с мембраной клетки.

В результате слияния мембран в цитоплазму клетки высвобождается нуклеокапсид и начинает функционировать вирионная РНК–зависимая ДНК–полимераза. Наличие РНК–зависимой ДНК–полимеразы является принципиальным отличием ретровирусов от вирусов других семейств. Процесс синтеза ДНК происходит в три этапа: синтез ДНК комплементарной вирусной РНК, ферментативное разрушение вирусной РНК и синтез второй цепи ДНК. Схема вирусной РНК представлена на рисунке 1.




ПП – повторяющиеся последовательности; 5’УП – уникальная последовательность с 5’конца гена;

3’УП – уникальная последовательность с 3’ конца гена; ПСУ – праймер – связывающий участок;

ППУ – полипуриновый участок


Рис. 1. Схема РНК ретровирусов


Обратная транскрипция, т.е. синтез цепи (–)ДНК и (+)ДНК начинается со 3’-ОН конца праймерной РНК. Затравкой для синтеза (-)ДНК является тРНК, связанная с праймер–связывающим участком на 5’ конце вирусной РНК. Для синтеза (+)ДНК праймером является полипуриновый участок, расположенный на 3’ конце вирусной РНК. После соединения тРНК с праймер-связывающим участком, с 3’ конца начинается синтез двух участков: уникальной последовательности 5’ конца и повторяющейся последовательности. Под действием РНКазы H, расщепляющей РНК в комплексах РНК-ДНК, высвобождается тРНК несущая на 3’ конце последовательность ДНК комплементарной уникальной последовательности 5’ конца и повторяющейся последовательности вирусной РНК. Данная последовательность комплементарно связывается с аналогичными участками на 3’ вирусной РНК и становится затравкой для синтеза (–)ДНК.

После действия РНКазы Н становится доступным полипуриновый участок, с которого начинается синтез (+)ДНК, при этом синтезируется небольшой отрезок ДНК, включающий уникальную последовательность на 3’ конце, повторяющуюся последовательность, уникальную последовательность на 5’ конце и праймер–связывающий участок. Последний становится затравкой для синтеза полной длины (+)ДНК, матрицей является (-)ДНК. Результатом обратной транскрипции становится провирусная ДНК с длинными концевыми повторами, которая встраивается в хромосомную ДНК. Схема обратной транскрипции представлена на рисунке 2.





Рис. 2. Схема обратной транскрипции


Провирусная ДНК, по-прежнему связанная с некоторыми белками вириона,
транспортируется в ядро как пре-интеграционный комплекс. При этом интеграция происходит только в процессе митоза клетки, так как необходимым условием проникновение провирусной ДНК является растворение мембраны ядра. Однако, некоторые вирусы данного семейства способны проникать в ядра покоящихся клеток.

Встраивание провирусной ДНК в хромосому клетки осуществляется при помощи белка интегразы. Экспрессия встроенного провируса может происходить непосредственно после интегрирования. Если такой экспрессии не происходит, инфекция приобретает латентный, т.е. скрытый характер. Если латентно инфицированная клетка делится, то провирус копируется вместе с геном клетки, и в каждой из дочерних клеток имеется копия провируса.

Транскрипция вирусной РНК начинается с последовательности 3’УП ПП участка. Данная последовательность расположена с двух концов провируса, имеют одну нуклеотидную последовательность, но несут разные функции. С 5’ конца данная последовательность является старт-кодоном для клеточной РНК полимеразы II, а со стороны 3’ конца стоп-кодоном.

Также как и прочие ретровирусы, геном вируса лейкоза крупного рогатого скота содержит gag, pol и env структурные и регуляторные гены [2]. Большинство структурных белков ВЛКРС иммуногенны и установлено, что инфицированные животные вырабатывают антитела к gp51 и gp30 гликопротеинам, а также к р24 и р15 белкам, являющимся продуктами gag гена [3, 4]. Трансляция гена env осуществляется с мРНК в эндоплазматическом ретикулуме, где сразу начинается процесс гликозилирования. Белки, экспрессируемые геном env, транспортируются в комплекс Гольджи, где под действием протеаз хозяина расщепляется на gp51 и gp30 молекулы. Эти два продукта расщепления остаются в тесной связи, и после дальнейшего гликозилирования они транспортируются к плазматической мембране. Гликопротеин (Env) вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из gp51 гликопротеина внешней мембраны и трансмембранного gp30 гликопротеина, непосредственно участвует в инфицировании клетки и вызывает сильный иммунный ответ у инфицированных животных [5].

Полипротеины Gag и Gag-Pol транслируются с длинного участка мРНК, названные gag и pol генами. Ретровирусы требуют гораздо большего количества белков Gag, чем Pol, в связи с этим у вируса развились механизмы синтеза необходимого количества каждого из этих белков. Механизм заключается в отключении приблизительно 95 процентов рибосомы после синтеза Gag, в то время как другие рибосомы продолжают синтезировать Gag-Pol.

В соответствии с биологией вируса, болезнь протекает в хронической форме по типу прогредиентной B-клеточной лейкемии/лимфомы и сопровождается снижением продуктивности зараженных животных, а в развернутых формах, на опухолевой стадии, приводит к их выбраковке. Показатель заболеваемости КРС лейкозом сильно варьирует в разных хозяйствах, причем неблагополучные по лейкозу фермы несут значительный экономический ущерб из-за вынужденного забоя, затрат на проведение противоэпизоотических и карантинных мероприятий и на пастеризацию молока [1, 6].

Приблизительно у 30% крупного рогатого скота, зараженного вирусом лейкоза, отмечается постоянный лимфоцитоз, а у 1-5% развивается B-клеточная лимфосаркома [7, 8, 9]. По классификации Международного эпизоотического бюро, вирус лейкоза крупного рогатого скота внесен в список наиболее широко распространенных болезней [10] и во многих странах включен в национальные программы по ликвидации болезни [11]. Наример, 89% молочных стад Соединенных Штатов заражены вирусом лейкоза [12]. По статистическим данным ветеринарной службы Японии, в 2000 году лейкоз был выявлен на 157 фермах, а в 2007 году – у 838 головы на 677 фермах [13].

Ретроспективный анализ распространения лейкоза крупного рогатого скота в Республике Казахстан показал, что в 2008 году было выявлено 39 799 голов больных животных, в 2009 году – 103 206 голов, в 2010 году – 64 413 голов. Наиболее широкое распространение заболевание получило в Северо-Казахстанской, Павлодарской и Западно-Казахстанской областях, где в 2010 году было выявлено 5% больных животных из всего исследованного поголовья. При этом, в Западно-Казахстанской области отмечалось повышение заболеваемости в 2008 году до 10%, в Павлодарской области в 2009 году до 50%. Несмотря на проводимые мероприятия по оздоровлению хозяйствующих субъектов от лейкоза крупного рогатого скота (ЛКРС), в республике сохраняется высокий уровень пораженности стад ЛКРС, опережая темпы распространения таких социально значимых болезней как туберкулез и бруцеллез.


Современные серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота


Заражение крупного рогатого скота вирусом и длительный инфекционный процесс приводит к образованию стойкого антительного ответа. Первые антитела могут быть обнаружены через 3-16 недель после заражения. Наиболее легко обнаруживаются антитела против gp51 и р24 антигенов вируса. При этом большинство иммунодиффузионных и иммуноферментных тестов основаны на использовании гликопротеина gp51, так как антитела к нему появляются первыми [14, 15].

Учитывая биологические свойства вируса и специфику иммунного ответа, важнейшим аспектом предотвращения распространения лейкоза среди животных является серологическая диагностика животных. В настоящее время, для серологической диагностики были разработаны различные варианты иммуноферментного анализа и реакции иммунодиффузии [1, 4, 6, 11, 12]. Реакция иммунодиффузии впервые была разработана в 1970-х, и стала первым серологическим тестом, принятым Международным эпизоотическим бюро (OIE) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота при международной торговле [16, 17, 18]. В Канаде, реакция иммунодиффузии до настоящего времени остается официальным диагностическим методом серологической диагностики ЛКРС. Этот тест используется с целью отбора животных для экспорта, отбора быков-производителей в центрах производства спермы и аккредитации стада в Canada Health Accredited Herd (CHAH) по программе Canadian Food Inspection Agency (CFIA).

Другим диагностическим тестом, принятым Международным эпизоотическим бюро, является иммуноферментный анализ. В отличие от реакции иммунодиффузии, иммуноферментный анализ обладает более высокой чувствительностью и позволяет получать как качественный, так и количественный результат [19, 20, 21]. В мире используются многочисленные варианты ИФА для исследования как отдельных, так и объединенных сывороток от больных лейкозом животных, при этом все используемые варианты иммуноферментного анализа обладают высокими диагностическими характеристиками, чем реакция иммунодиффузии [22-30].

Сравнительный анализ чувствительности тест-систем с использованием различных вариантов разведения исследуемых сывороток, проведенный в Европе, выявил, что все варианты иммуноферментного анализа и реакция иммунодиффузии на референтных сыворотках демонстрируют средние результаты. Например, реакция иммунодиффузии, непрямой вариант ИФА и ИФА на основе моноклональных антител к p24 выявляли антитела в разведении сыворотки 1/16, ИФА на основе моноклональных антител к gp5l в разведении 1/128 и конкурентный вариант ИФА в разведении 1/1024 [31]. В другом исследовании, непрямой вариант ИФА был откалиброван референтными сыворотками, в результате чего увеличился порог чувствительности до разведений от 12800 до 25600 [29]. В Дании сравнительные исследования блокирующего ИФА на основе биотин-авидиновой системы и реакции иммунодиффузии показал превышение чувствительности ИФА в 50-100 раз [32]. Помимо сравнительного анализа выше перечисленных типов ИФА, в литературе встречаются сообщения об исследовании ИФА на основе моноклональных антител к p24 антигену [33], конкурентном варианте ИФА на основе 2 моноклональных антител [34], непрямом сэндвич-варианте на основе 2 моноклональных антител [35], блокирующем варианте ИФА на основе моноклональных антител к p24 [36] и тест ИФА на основе рекомбинантного p24 антигена [37]. Все варианты иммуноферментного анализа по своей чувствительности превышали реакцию иммунодиффузии.

Из вышесказанного видно, что серологическая диагностика лейкоза в основном базируется на выявлении антител, специфичных к gp51 антигену. Отсюда следует, что диагностические процедуры, которые используют gp51 антиген, являются важными мероприятиями при разработке эффективных программ по ликвидации заболевания. В последние десятилетия разработаны различные варианты иммуноферментного анализа на основе очищенного gp51 антигена и моноклональных антител против gp51 [38-41]. Эти варианты ИФА оказались наиболее эффективными при исследовании образцов с низким титром антител, такие как молоко образцов или объединенные сыворотки. Преимущество использования gp51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота связано с тем, что в период инфекционного процесса антитела к gp51 появляются раньше, чем к p24 антигену, следовательно, концентрация антител к gp51 антигену в сыворотке крови больных животных выше.

Carole Simard (2000) при исследовании четырех коммерческих наборов ИФА из США и Европы, применяемых для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота и набора для реакции иммунодиффузии, выявил высокую степень корреляция между ними. При этом, наборы ИФА №1, 2 и 3 рассчитаны для выявления антител к gp51 антигену, набор №4 для выявления антител к р24 антигену вируса. Из 704 образцов, отрицательных в реакции иммунодиффузии, наборы ИФА за №1 и 2 показали полностью идентичный результат, в то время как наборы ИФА №3 и 4 показали 0,43 и 0,28% ложноположительных результатов, соответственно. Высокая степень корреляции отмечалась при исследовании чувствительности данных наборов. Наборы №1 и 2 продемонстрировали 100% совпадение с реакцией иммунодиффузии при исследовании 490 положительных образцов, набор №3 показал 0,41% ложноотрицательных результатов. Наиболее худший результат продемонстрировал набор №4 – 5,13% [42].

Другой сравнительный анализ реакции иммунодиффузии на основе gp51 антигена и иммуноферментного анализа на основе р24 антигена показал 96,7% совпадение при исследовании отрицательных образцов (специфичность) и 98,1% совпадение при исследовании положительных образцов (чувствительность) [43]. Сравнительный анализ иммуноферментных тест-систем между собой, показал равнозначные результаты.

Сравнение чувствительности тест-систем проведенное рядом авторов в полевых условиях, показало, что иммуноферментный анализ на основе gp5l и реакция иммунодиффузии на основе gp5l антигена обладают одинаковой чувствительностью [29, 44, 45, 46]. По мнению других авторов, иммуноферментный анализ более чувствителен, чем реакция иммунодиффузии, так как ИФА выявлял антитела значительно раньше, чем реакция иммунодиффузии [47, 48].

В исследованиях Carole Simard (2000) существенное различие по чувствительности между тест-системами наблюдалось только при разведении образцов. Реакция иммунодиффузии оказалась менее чувствительной и обнаруживала антитела в разведении сыворотки только 1/100, тогда как все иммуноферментные тест-системы могли выявлять антитела в разведении 1/5000. При этом, наиболее высокие результаты были получены набором №2, представляющим собой непрямой вариант иммуноферментного анализа с использованием в качестве подложки планшеты, иммобилизованные gp51 специфическими моноклональными антителами. Набор №3 был блокирующим вариантом иммуноферментного анализа, где специфические антитела из пробы сыворотки связывались с иммобилизованным gp5l антигеном, блокируя тем самым связывание анти-gp5l-конъюгированных моноклональных антител. Из результатов, полученных автором, можно сделать заключение, что иммуноферментные тест-системы на основе gp51 антигена, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью, могут использоваться в качестве теста при исследовании объединенных образцов сыворотки, что значительно сократило бы затраты на проведение диагностических исследований [42].


Рекомбинантные антигены вируса и их диагностическое значение


Во время вирусной инфекции хозяина, гликопротеин gp51 и основной структурный белок вируса p24 являются основными целями для иммунной системы. В связи с этим значительная часть исследований посвящена получению рекомбинантных антигенов. В качестве источника gp51 и р24 антигена является вирус, получаемый из линии клеток почек эмбриона овцы (FLK), хронически инфицированных вирусом. Данный метод является малоэффективным и трудоемким, с очень низким выходом конечного продукта. В последние десятилетия различные исследователи описали экспрессию гликопротеинов гена Env в гетерологичных системах, таких как кишечная палочка [49, 50, 51], Saccharomyces cerevisiae [52], а также в системе рекомбинантного вируса коровьей оспы [53, 54] и, в последнее время, в системе бакуловируса [55, 56].

G. Gutieґrez с соавторами (2009) амплифицировали полную нуклеотидную последовательность p24 антигена из провируса, выделенного в Бельгии. В качестве экспрессирующей системы использовалась кишечная палочка. При этом нуклеотидная последовательность амплифицированного гена была полностью гомологична генам р24 антигена вируса, изолированного в Бельгии, Аргентине, Австралии и Японии. Более того, полная нуклеотидная и аминокислотная характеристика p24 антигена полевых штаммов вируса полностью подтвердила предположение, что циркулирующие штаммы не достаточно вариабельны, чтобы вырабатывать антитела, не реагирующие с рекомбинантным р24 антигеном, включенным в иммуноферментный анализ [57].

По мнению Dube S. с соавторами (2000), р24 антиген является высоко консервативным белком с максимальной изменчивостью 5,5% у штаммов вирусов из различных географических регионов. По сути, рекомбинантный р24 белок вируса может применять для исследования сывороток из различных географических регионов, что доказано исследованиями референтных сывороток из Европы и США методом иммуноблотинга. При этом препараты рекомбинантного р24 антигена, в отличие от препаратов, полученных из культуры клеток FLK, обладают следующим преимуществом, отсутствием клеточных компонентов, которые могут влиять на специфичность реакции [58].

Однако при исследовании иммуноферментным анализом на основе рекомбинантного р24 антигена референтных позитивных сывороток в количестве 207 и негативных в количестве 348 проб было выявлено, что около 5-6% образцов из каждой группы не соответствуют своему определенному статусу. По мнению ряда авторов, причинами такого несовпадения могут быть или выявление антител, не выявляемых реакцией иммунодиффузии и иммуноферментным анализом на основе gp51антигена, или все-таки возможны ложноположительные реакции, так как даже очищенный рекомбинантный p24 белок может давать неспецифические реакции [36, 43, 59, 60]. Все эти положительные реакции не объясняются наличием неспецифической реакции тиоредоксина кишечной палочки, присутствующего в рекомбинантном p24 антигене и неспецифической активности полистеролового планшета [43, 61].

Тем не менее, по результатам большинства исследований, иммуноферментный анализ на основе рекомбинантного p24 антигена обладает более лучшей аналитической чувствительностью, чем реакция иммунодиффузии [29, 62, 63, 64, 65].

Alejandra Larsen с соавторами (2012) для экспрессии рекомбинантного p24 антигена, выделенного из вируса, выращенного в клеточной линии FLK, использовали бакуловирус как вектор. Анализ нуклеотидной последовательности показал 99,7% гомологию со штаммом вируса, изолированного в Японии и США, и 98% гомологию со штаммами, изолированными в Аргентине и Австралии. Клеточная линия Sf21, инфицированная p24-бакуловирусами, экспрессировала рекомбинантный белок p24. Молекулярный вес рекомбинантного белка составлял 24 кДа. Однако, при использовании авторами рекомбинантного p24 белка в качестве антигена в иммунодиагностических тестах наблюдалась неспецифическая реакция на компоненты среды культуры клеток или другие вирусы, которые могут присутствовать в клеточной линии производителя [66].

De Giuseppe с соавторами (2004) экспрессировали белок gp51 вируса в клетках насекомых с использованием рекомбинантного бакуловируса и оценили его диагностические возможности в иммуноферментном анализе. С этой целью авторами был использован ATG кодон в положении 4826 нуклеотидной последовательности. Выбор был связан с тем, что данная сигнальная последовательность кодирует 33 аминокислоту в N-терминальной последовательности, предшествующей аминокислотной последовательности gp51 антигена [67]. Эта гипотеза подтверждена в других исследованиях, показавших, что при экспрессии Env гликопротеинов вируса выделение gp51 антигена не происходит без сигнальной последовательности. Более того, экспрессионные системы, в которых Env гликопротеины вируса или gp51 антиген экспрессированы с сигнальной последовательностью, производят необходимые белки [68, 69].

По мнению De Giuseppe (2004), секретируемый gp51 имеет несколько преимуществ по сравнению с внутриклеточными gp51 или gp51, продуцируемых вирусом в клетках млекопитающих. Во-первых, очистка рекомбинантного gp51 антигена проста и позволяет преодолеть проблемы загрязнения дебрисными белками клеток насекомых или эмбриональной телячьей сыворотки.

Полученная аминокислотная последовательность обладала высокой степенью гомологии с gp51 антигеном нативного вируса. Анализ рекомбинантного gp51 антигена методом Вестерн-блоттинга показал наличие нескольких рекомбинантных белковых фракций от 32 до 50 кДа. По мнению других авторов, полученные результаты могли быть причиной неполного и неправильного гликозилирования молекул, часто наблюдаемые в клетках насекомых [70] и различных клеточных линий млекопитающих [71]. Однако, несмотря на неполное или неправильное гликозилирование, в иммуноферментном анализе антигенные характеристики рекомбинантного gp51 антигена были идентичны нативным белкам.

По данным De Giuseppe (2004), применение рекомбинантного gp51 антигена привело к улучшению диагностических характеристик ИФА, продемонстрировав 100% специфичность при исследований 1230 образцов сыворотки, в то время как специфичность предыдущих тест-систем составила 99%.

Тем не менее, уровень диагностических технологий и достижения прикладной науки в области диагностики инфекционных болезней требует более глубокого понимания антигенных свойств патогенов и их иммуногенности. По мнению ряда исследователей, решением данной проблемы могут быть синтетические пептиды, некоторые из которых использовались для картирования антигенных сайтов у вирусов [72, 73, 74]. Синтетические пептиды как миметики антигенных и иммуногенных сайтов имеют широкий потенциал использования их в качестве антигенов в диагностических системах и как эффективные компоненты вакцин [55, 75, 76]. Данные технологии позволяют избежать проблем, связанных с применением антигенов, полученных на культуре клеток [77, 78, 79].

Elizangela Maira dos Santos с соавторами (2012) использовали пептиды, полученные технологией фагового дисплея, в разработке методом иммуноанализа энзоотического лейкоза крупного рогатого скота. Эти пептиды были расценены как антигенные миметики иммуногенных эпитопов белков вируса лейкоза крупного рогатого скота, обладающих потенциалом при разработке диагностических тест-систем [80].

Клоны фагов, несущие пептиды, мимикрирующие антигены вируса, отбирались с помощью иммуноглобулинов, очищенных из сывороток крупного рогатого скота, больных лейкозом. Многократное клонирование с отбором наиболее активных клонов в иммуноанализе позволило получить клоны, продуцирующие пептиды с высоким сродством к IgG от больных животных. В результате автором получены 44 пептида с высокой частотой встречаемости таких аминокислот как аланин, гистидин, пролин и триптофан. Из этих 44 пептидов, методами иммуноферментного анализа, Дот-блота и Вестерн-блота были отобраны только 23 пептида, 9 из которых различали положительные и отрицательные сыворотки во всех трех вариантах анализов.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей полученных пептидов показал их гомологию с р24 антигеном, gp51 и gp30 гликопротеинами. Пептиды из клонов D10, G5 и A9 гомологичны с белком p24, который рассматривается как основной капсидный белок вируса лейкоза крупного рогатого скота, а пептид клона D4 имеет высокую степень гомологии с gp51 гликопротеином вирусной оболочки.


Заключение


Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота вызывает стойкий лимфоцитоз, характеризующийся постоянным и стабильным увеличением количества В-лимфоцитов в периферической крови. У большинства инфицированных животных заболевание может протекать бессимптомно, вследствие заражения менее 1% клеток периферической крови. Вирус передается горизонтально, путем передачи инфицированной клетки через прямой контакт, через молоко и, возможно, через укусы насекомых. Значительный вклад в распространение болезни вносят процедуры по удалению рогов, маркировка уха, татуировка и любое использование зараженных игл. Энзоотический лейкоз в настоящее время широко распространен в ряде регионов мира (например, США) и вызывает основные экономические потери. Например, по данным Nicolas Gillet (2007), потери в молочной промышленности США в 2003 году оценивались в 525 миллионов долларов. В странах Европейского Союза болезнь почти полностью искоренена путем многолетнего уничтожения инфицированных животных. Из-за дороговизны программы ликвидации болезни искоренение инфекции возможно только в регионах, где распространенность вируса низка [81].

По данным МЭБ, серологические тесты чаще всего используются для выявления антител против вируса реакцией иммунодиффузии и иммуноферментным анализом (ИФА). Серологическая диагностика энзоотического лейкоза крупного рогатого скота в основном базируется на антитела к р24 и gp51 антигену. Отсюда следует, что диагностические процедуры на основе р24 и gp51 антигена являются важной предпосылкой для разработки эффективных программ ликвидации инфекции. Для этих целей разработаны различные варианты иммуноферментного анализа на основе препаратов gp51 антигена и анти-gp51 моноклональных антител.

Основанием для применения p24 антигена в дополнении к часто используемому gp51 антигену является предположение, что некоторые животные могут продуцировать антитела к p24, не определяемые другими тестами.

Развитие методологических подходов в диагностике инфекционных болезней привело к использованию синтетических пептидов мимикрирующих антигенные эпитопы диагностически важных антигенов вируса. Синтетические пептиды являются прекрасной альтернативой использованию нативных и рекомбинантных вирусных антигенов. Однако, научная мысль не стоит на месте, и на сегодняшний день разработаны более эффективные способы получения антигенных препаратов. Пептиды, гены которых синтезированы de novo и экспрессированы в гетерологических системах как кишечная палочка, могут использоваться в качестве антигенов для диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота.


Литература


1. Burny A., Bruck C., Cleuter Y. et al. Bovine leukaemia virus and enzootic bovine leucosis // Onderstepoort J. Vet. Res. – 1985. – №52. - Р. 133–144.

2. Sagata N., Yasuaga T., Tsuzuku-Kawamura J., Ohish K., Ogawa Y., Ikawa Y. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: Its evolutionary relationship to other retroviruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1985. – №82. - Р. 677-681.

3. Deshayes L., Levy D., Parodi A.L., Levy J.P. Spontaneous immune response of bovine leukemia viruse infected cattle against five different viral proteins // Int. J. Can. – 1980. – №25. - Р. 503-508.

4. Bicka L., Kuzmak J., Kozaczynska B., Plucienniczak A., Skorupska A. Expression of bovine leukemia virus protein p24 in Escherichia coli and its use in the immunoblotting assay // Acta. Biochim. Pol. – 2001. – №48. - Р. 227-232.

5. Van der Maaten M., Miller J. M. Bovine leukosis virus. In Z. Dinter and B. Morein (ed.), Virus infections of ruminants. Elsevier Science Publishers B.V. - Amsterdam, The Netherlands, 1990. – P. 419–429.

6. Смирнов П.Н. Лейкоз крупного рогатого скота: проблемы и их решение на уровне субъекта федерации // Ветеринария Кубани. – 2007. – №4. - С. 4-6.

7. Coulston J., Nail H., Brandon R., et. al. 1990. Molecular cloning and sequencing of an Australian isolate of proviral bovine leukaemia virus DNA: comparison with other isolates // Journal of General Virology. - 1990. – №71. – P. 1737-1746.

8. Samagh B.S., Kellar J.A. Seroepidemiological survey of bovine leukaemia virus infection in Canadian cattle. 4th Int Symp Bovine Leukosis. - Brussels-Luxembourg, 1982. - P. 397-412.

9. Burridge M.J., Puhr D.M., Hennemann J.M. Prevalence of bovine leukemia virus infection in Florida // J. Am. Vet. Med. Assoc. – 1981. – №179. – P. 704-707.

10. Zhao X., Buehring G. Natural genetic variations in bovine leukemia virus envelope gene: possible effects of selection and escape // Virology. – 2007. – №366. – P.150–165.

11. Sagata N., Yasuaga T., Tsuzuku-Kawamura J., Ohish K., Ogawa Y., Ikawa Y. Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: Its evolutionary relationship to other retroviruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1985. – №82. - Р. 677-681.

12. Deshayes L., Levy D., Parodi A.L., Levy J.P. Spontaneous immune response of bovine leukemia viruse infected cattle against five different viral proteins // Int. J. Can. – 1980. – №25. - Р. 503-508.

13. Sota Kobayashi, Toshiyuki Tsutsui, Takehisa Yamamoto, Yoko Hayama, Ken-ichiro Kameyama, Misako Konishi, Kenji Murakami. Risk factors associated with within-herd transmission of bovine leukemia virus on dairy farms in Japan // Veterinary Research. – 2010. – 6. http://www.biomedcentral.com/1746-6148/6/1

14. Devare S.G., Chander S., Samagh B.S., Stephenson J.R. Evaluation of radioimmunoprecipitation for the detection of bovine leukemia virus infection in domestic cattle // J. Immunol. – 1977. – №119. – Р. 277-282.

15. Portetelle D., Mammerickx M. ELISA, a highly sensitive and specific method for diagnosis of bovine leukemia virus infection // In: Burny A, Mammerickx M, eds. Enzootic bovine leukosis and bovine leukemia virus. - Boston: Martinus Nijhoff Publishing, 1987. – Р. 201-217.

16. Miller J.M, Schmerr M.J, Van Der Maaten M.J. Comparison of four serologic tests for the detection of antibodies to bovine leukemia virus // Am. J. Vet. Res. – 1981. - №42(1). - Р. 5-8.

17. Gutieґrez G., Alvarez I., Fondevila N., Politzki R., Lomoґnaco M., Rodriguez S., Dus Santos M.J., Trono Veterinary K. Detection of bovine leukemia virus specific antibodies using recombinant p24-ELISA // Microbiology. – 2009. – №137. - P. 224–234.

18. Juliarena M.A., Poli M., Ceriani C., Sala L., Rodríguez E., Gutierrez S., Dolcini G., Odeon A., Esteban E.N. Antibody response against three widespread bovine viruses is not impaired in Holstein cattle carrying bovine leukocyte antigen DRB3.2 alleles associated with bovine leukemia virus resistance // Dairy Sci. - 2009. - №92(1). - P.375-81.

19. Bondzio A, Blankenstein P, Risse S. Effects of hydrogen peroxide on bovine leukemia virus expression // Biol. Chem. - 2003. - №384(7). - P. 1063-72.

20. Buehring G.C., Philpott S.M., Choi K.Y. Humans Have Antibodies Reactive with Bovine Leukemia Virus // AIDS Res Hum Retroviruses. – 2003. - №19(12). - P.1105-13.

21. De Giuseppe A, Feliziani F, Rutili D, De Mia GM. Expression of the bovine leukemia virus envelope glycoprotein (gp51) by recombinant baculovirus and its use in an enzyme linked immuno sorbent assay // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2004. – №11. - P.147–151.

22. Van den Heuvel M.J, Jefferson B.J, Jacobs R.M. Purified bovine plasma blocking factor decreases bovine leukemia virus p24 expression while increasing protein synthesis and transcriptional activity of peripheral blood mononuclear cells in short-term culture // Can. J. Vet. Res. – 2005. – №69. - P. 186-192.

23. Van den Heuvel M.J, Portetelle D., Jefferson B., Jacobs R.M. Adaptation of a sandwich enzyme linked immuno sorbent assay to determine the concentration of bovine leukemia virus p24 and optimal conditions for p24 expression in short-term cultures of peripheral blood mononuclear cells // J. Virol. Methods. – 2003. – №111. – P.61-67.

24. Hassan M. Cloning and phylogenetic analysis of bovine leukaemia virus gag gene in Iranian isolate // African J. Microbiol. Res. – 2010. - №4(3). - P. 218-221.

25. Momtaz H., Hemmatzadeh F., Keyvanfar H. Expression of Bovine leukaemia virus p24 Protein in Bacterial Cell // Pakistan J. of Biol. Sci. – 2008. - №11(20). – P. 2433-2437.

26. Nguyen V.K., Maes R.F. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to bovine leukemia virus in serum and milk // J. Clin. Microbiol. – 1993. – №31. – P. 979-981.

27. Mammerickx M., Portetelle D., Burny A. The diagnosis of enzootic bovine leukosis // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. – 1985. – №8. – P. 305-309.

28. Hoff-Jorgensen R. Diagnosis of enzootic bovine leucosis in single and pooled samples // Rev. Sci. Tech. – 1990. – №9. – P. 1169-1173.

29. Klintevall K., Naslund K., Svedlund G., Hajdu L., Linde N., Klingeborn B. Evaluation of an indirect ELISA for the detection of antibodies to bovine leukaemia virus in milk and serum // J. Virol. Methods. – 1991. – №33. – P. 319-333.

30. Carli KT., Batmaz H., Sen A., Minbay A. Comparison of serum, milk and urine as samples in an enzyme immunoassay for bovine leukaemia virus infection // Res. Vet. Sci. – 1993. – №55. – P. 394-395.

31. Hoff-Jorgensen R. An international comparison of different laboratory tests for the diagnosis of bovine leukosis: suggestions for international standardization // Vet. Immunol. Immunopathol. – 1989. – №22. – P. 293-297.

32. Have P., Hoff-Jorgensen R. Demonstration of antibodies against bovine leukemia virus (BLV) by blocking ELISA using bovine The Canadian Journal of Veterinary Research 105 polyclonal anti-BLV immunoglobulin // Vet. Microbiol. – 1991. – №27. – P. 221-229.

33. Platzer C., Siakkou H., Kraus G., Grobel C., Rosenthal S. Use of monoclonal antibody against major internal protein p24 of bovine leukemia virus in capture ELISA // Arch. Exp. Veterinarmed. – 1990. – №44. – P. 917-923.

34. Portetelle D., Mammerickx M., Burny A. Use of two monoclonal antibodies in an ELISA test for the detection of antibodies to bovine leukaemia virus envelope protein gp5l // J. Virol. Methods. – 1989. – №23. – P. 211-222.

35. De Boer G.F., Boerrigter H.M., Akkermans J.P., Brenner J. Use of milk samples and monoclonal antibodies directed against BLVp24 to identify cattle infected with bovine leukemia virus (BLV) // Vet. Immunol. Immunopathol. – 1989. – №22. – P.283-292.

36. De Boer G.F., Boerrigter H.M., Groen J., Osterhaus A.D. Identification of bovine leukemia virus (BLV) infected cattle by complex-trapping-blocking (CTB) ELISA employing monoclonal antibodies directed against BLV-p24 // Zenbl. Vet. Med. – 1987. – №34. – P. 717-728.

37. Siakkou H., Kube D., Peters H., Otto A., Ulrich R., Rosenthal S. New ELISA test for detection of bovine leukemia virus infections in cattle, using bacterially synthesized p24 // Arch. Exp. Veterinarmed. – 1990. – №44. – P. 925-930.

38. Meas S., Ohashi K., Turn S., Chhin M., Те К., Miura К., Sugimoto С., Onuma M. Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus and bovine leukemia virus in draught animals in Cambodia // J. Vet. Med. Sci. – 2000. -Vол. 62, №7. - P. 779-781.

39. Meas S., Ruas F.J., Usui T., Teraoka Y., Mulenga A., Chang K.S., Masuda A., Madruga C.R., Ohashi K., Onuma M. Seroprevalence and molecular evidence for the presence of bovine immunodeficiency virus in Brazilian cattle // Jpn. J. Vet. Res. – 2002. - Vол. 50, №1. - P. 9-16.

40. Bruck C., Portetelle D., Mammerickx M., Mathot M., Burny A. Epitopes of BLV glycoprotein gp51 recognized by sera of infected cattle and sheep // Leukemia Res. – 1984. – №8. – P. 315.

41. Portetelle D., Bruck C., Mammerickx M., Burny A. Use of monoclonal antibody in an ELISA test for detection of antibodies to bovine leukemia virus // J. Virol. Methods. – 1983. – №6. – P. 19–29.

42. Simard C., Richardson S., Dixon P., Belanger C., Maxwell P. Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of bovine leukosis: comparison with the agar gel immunodiffusion test approved by the Canadian Food Inspection Agency // The Canadian Journal of Veterinary Research. – 2000. – №64. – P. 101-106.

43. Molloy J.B., Walker P.J., Baldock F.C., Rodwell B.J., Cowley J.A. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine leukaemia virus p24 antibody in cattle // J. Virol. Methods. – 1990. – №28. – P. 47-57.

44. Graves D.C., McQuade M., Weibel K. Comparison of the enzymelinked immunosorbent assay with an early polykarycytosis inhibition assay and the agar-gel immunodiffusion test for the detection of antibodies to bovine leukemia virus // Am. J. Vet. Res. – 1982. – №43. – P. 960-966.

45. Todd D., Adair B.M. An enzyme-linked immunosorbent assay for enzootic bovine leukaemia virus antibodies // Vet. Rec. – 1980. – №107. – P. 124-126.

46. Ressang A.A., Gielkens A.L.J., Quak J., Mastenbroek M.N. Studies on bovine leukosis VII. Further experience with an ELISA for the detection of antibodies to bovine leukemia virus // Vet. Q. – 1981. – №3. – P. 31-33.

47. Mammerickx M., Portetelle D., Bruck C., Burny A. Le diagnostic de la leucose bovine enzootique a l'aide d'un test immunoenzymatique (ELISA) impliquant un anticorps monoclonal // Ann. Med. Vet. – 1984. – №128. – P. 55-63.

48. Klintevall K., Ballagi-Pordiany A., Niaslund K., Beliak S. Bovine leukaemia virus: rapid detection of proviral DNA by nested PCR in blood and organs of experimentally infected calves // Vet. Microbiol. – 1994. – №42. – P. 191-204.

49. Ban J., Czene S., Altaner C., Callebaut I., Krchnak V., Merza M., Burny A., Kettmann R., Portetelle D. Mapping of sequential epitopes recognized by monoclonal antibodies on the bovine leukemia virus external glycoprotein expressed in Escherichia coli by means of antipeptide antibodies // J. Gen. Virol. – 1992. – №73. – P. 2457–2461.

50. Siakkou H., Ulrich R., Uelze A., Mohring R., Rosenthal S. Immunological characterization of BLV proteins synthesized in Escherichia coli. // Acta Virol. – 1990. – №34. – P. 256–262.

51. Ulrich R., Siakkou H., Platzer C., Bossmann H., Mohring R., Wiedmann M., Bahring S., Rosenthal S. Synthesis of bovine leukemia virus antigen in Escherichia coli // Arch. Exp. Vet. Med. Leipzig. – 1990. – №44. – P. 909–916.

52. Legrain M., Portetelle D., Dumont J., Burny A., Hilger F. Biochemical and immunological characterization of the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein (gp51) produced in Saccharomyces cerevisiae // Gene. – 1989. – №79. – P.227–237.

53. Kumar S., Andrew M.E., Boyle D.B., Brandon R.B., Lavin M.F., Daniel R.C. W. Expression of bovine leukemia virus envelope gene by recombinant vaccinia virus // Virus Res. – 1990. – №17. – P. 131–142.

54. Portetelle D., Limbach K., Burny A., Mammerickx M., Desmettre P., Riviere M., Zavada J., Paoletti E. Recombinant vaccinia virus expression of the bovine leukemia virus envelope gene and protection of immunized sheep against infection // Vaccine. – 1991. – №9. – P. 194–200.

55. Kabeya H., Ohashi K., Ohishi K., Sugimoto C., Amanuma H., Onuma M. An effective peptide vaccine to eliminate bovine leukemia virus (BLV) infected cells in carrier sheep // Vaccine. – 1996. – №14. – P. 1118–1122.

56. Russo S., Montermini L., Berkovitz-Siman-Tov R., Ponti W., Poli G. Expression of bovine leukemia virus Env glycoprotein in insect cells by recombinant baculovirus // FEBS Lett. – 1998. – №436. – P. 11–16.

57. Gutieґrez G., Alvarez I., Fondevila N., Politzki R., Lomoґnaco M., Rodriguez S., Dus Santos M.J., Trono Veterinary K. Detection of bovine leukemia virus specific antibodies using recombinant p24-ELISA // Microbiology. – 2009. – №137. - P. 224–234.

58. Dube S., Dolcini G., Abbott L., Mehta S., Dube D., Gutierrez S., Ceriani C., Esteban E., Ferrer J., Poiesz B. The complete genomic sequence of a BLV strain from a Holstein cow from Argentina // Virology. – 2000. – №277. – P. 379–386.

59. Kaaden O.R., Lange S., Romanovsky W., Marrer H., Pfeilsticker J., Roselius R. Transient viraemia with bovine leukaemia virus in bulls // Zbl. Vet. Med. – 1982. – №29. – P. 269–274.

60. Greiner M., Gardner I.A. Epidemiologic issues in the validation of veterinary diagnostic tests // Prev. Vet. Med. – 2000. – 45. – P. 3–22.

61. Kittelberger R., Laybourn B.J., Diack D.S., Penrose M.E., Reichel M.P., Motha J., Molloy J.B., Merza M. Evaluation of electrophoretic immunoblotting for the detection of antibodies against the bovine leukosis virus in cattle // J. Virol. Methods. – 1996. – 61. – P. 7–22.

62. Sargeant J.M., Kelton D.F., Martin S.W., Mann E.D. Evaluation of a bulk-milk ELISA test for the classification of herd-level bovine leukemia virus status // Prev. Vet. Med. – 1997. – №31. – P. 223–230.

63. Reichel M.P., Tham K.M., Barnes S., Kittelberger R. Evaluation of alternative methods for the detection of bovine leukaemia virus in cattle // N.Z.Vet.J. – 1998. – №46. – P. 140–146.

64. Trono K.G., Perrez-Filgueira D.M., Duffy S., Borca M.V., Carrillo C. Seroprevalence of bovine leukemia virus in dairy cattle in Argentina: comparison of sensitivity and specificity of different detection methods // Vet. Microbiol. – 2001. – №83. – P. 235–248.

65. Monti G.E., Frankena K., Arngel B., Buist W., Tarabla H.D., de Jong M.C. Evaluation of a new antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of bovine leukemia virus infection in dairy cattle // J. Vet. Diagn. Invest. – 2005. – №17. – P. 451–457.

66. Larsen A., Gonzalez E.T., Serena M.S., Echeverrı´a M.G., Mortola E. Expression of p24 gag Protein of Bovine Leukemia Virus in Insect Cells and Its Use in Immunodetection of the Disease // Mol Biotechnol. – 2012. - DOI 10.1007/s12033-012-9587-7.

67. De Giuseppe A., Feliziani F., Rutili D., De Mia G.M. Expression of the bovine leukemia virus envelope glycoprotein (gp51) by recombinant baculovirus and its use in an enzyme linked immuno sorbent assay // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2004. – №11. - P.147–151.

68. Merza M., Sundquist B., So¨ber J., Morein B. Immunoaffinity purification of two major proteins of bovine leukemia virus (gp51 and p24) and their use for discrimination between vaccinated and infected animals // J. Virol. Methods. – 1991. – №33. – P. 345–353.

69. Voneche V., Portetelle D., Kettmann R., Willems L., Limbach K., Paoletti E., Ruysschaert J. M., Burny A., Brasseur R. Fusogenic segment of bovine leukemia virus and simian immunodeficiency virus are interchangeable and mediate fusion by means of oblique insertion in the lipid bilayer of their target cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1992. – №89. – P. 3810–3814.

70. Noteborn M.H.M., de Boer G.F., Kant A., Koch G., Bos J.L, Zantema A., Van der Eb A.J. Expression of avian leukemia virus env-gp85 in Spodoptera frugiperda cells by use of baculovirus expression vector // J. Gen. Virol. – 1990. – №71. – P. 2641–2648.

71. Zajac V., Slavikova K., Babusikova O. Expression of env gene of bovine leukemia virus in rodent cells // Arch. Virol. – 1994. – №135. – P. 201–207.

72. Neurath A.R., Strick N., Lee E.S.Y. B cell epitope mapping of human immunodeficiency virus envelope glycoproteins with long (19- to 36-residue) synthetic peptides // J. Gen. Virol. – 1990. – №71. – P. 85-95.

73. Callebaut I., Burny A., Krchnák V., Gras-Masse H., Wathelet B., Portetelle D. Use of Synthetic Peptides to Map Sequential Epitopes Recognized by Monoclonal Antibodies on the Bovine Leukemia Virus External Glycoprotein // Virol. – 1991. – №185. – P. 48-55.

74. Ball J.M., Rushlow K.E., Issel C.J., Montelaro R.C. Detailed Mapping of the Surface Unit Glycoprotein of Equine Infectious Anemia Virus by Using Synthetic Peptide Strategies // J. Virol. – 1992. – №66. – P. 732-742.

75. Soutullo A., Verwimp V., Riveros M., Pauli R., Tonarelli G. Desing and validation of an ELISA for equine infectious anemia (EIA) diagnosis using synthetic peptides // Vet. Microbiol. – 2001. – №79. – P. 111-121.

76. Soutullo A., García M.I., Bailat A., Racca A., Tonarelli G., Borel I.M. Antibodies and PBMC from EIAV infected carrier horses recognize gp45 and p26 synthetic peptides // Vet. Immunol. Immunopathol. – 2005. – №108. – P. 335-343.

77. Folgori A., Tafi R., Meola A., Felici F., Galfre G., Cortese R., Monaci P., Nicosia A. A general strategy to identify mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries and human sera // EMBO J. – 1994. – №13. – P. 2236-2243.

78. Pasqualini R., Koivunen E., Ruoslahti E. A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an RGD-binding site on integrins // J. Cell Biol. – 1995. – №130. – P. 1189-1196.

79. Sioud M., Forre O., Dybwad A. Selection of ligants for polyclonal antibodies from random peptide libraries: potential identification of (auto) antigens that may trigger B and T cell responses in autoimmune diseases // Clin. Immunol. Immunopathol. – 1996. – №79. – P. 105-114.

80. dos Santos E.M., Cardoso R., Filho L.R. G., Heinemann M. B., Leite R. C., Pimenta dos Reis J.K.. Selection of ligand peptides with the ability to detect antibodies in enzootic bovine leukosis // African Journal of Biotechnology. – 2012. – №11. – P.7302-7312.

81. Gillet N., Florins A., Boxus M., Burteau C., Nigro A., Vandermeers F., Balon H., Bouzar A.-B., Defoiche J., Burny A., Reichert M., Kettmann R., Willems L. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human // Retrovirology. - 2007. – №4. – P. 1-32.


Түйін


Осы шолуда ірі қара мал лейкозының вирусы туралы жалпы мәлiметтер көрсетілген, провирусты днқ синтезделу процесі және жасушаның хромосомасына еңгізу процесі сипатталған. Энзоотикалық ірі қара мал лейкозын диагностикасы үшiн иммуноферменттік талдауының әр түрлi варианттарын салыстырмалы талдауы көрсетілген. Вирустың рекомбинантты антигендерін алу әдістері және вирустың синтездік пептидтер маңызды диагностикалық эпитоптарына салыстырмалы талдауы берілген.


Summary


There is presented general information about the virus of leucosis of the cattle in the review, the synthesis process of proviral DNA and its transport into cell chromosome are described. The comparative analysis of different variants of enzyme linked immune sorbent assay, worked out for diagnostics of enzootic leucosis of the cattle, is shown. The comparative analysis of receipt methods of virus recombinant antigens and synthetic peptids, mimicrying important diagnostic epitopes of virus, is given.


Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconУдк 619: 616-07 Метод выделения ДНК и тест-система пцр в реальном времени для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconОсобенности лейкоза крупного рогатого скота и современные методы его диагностики

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconУдк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа
Ргп «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» кн мон рк, пгт. Гвардейский, Кордайский район, Жамбылская...

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconУтвердить план оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза на 2011 год (приложение). Постановление подлежит официальному опубликованию
Ростовской области от 12. 05. 2005 №315-зс «Об областной целевой программе оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза на 2005...

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconОценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconРезультаты изучения генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенности эпизоотологического и гематологического проявления лейкоза 16.

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconЭффективность диагностических тестов в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых от лейкоза стадах 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconПрофилактика лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconПроблемы, связанные с диагностикой лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота iconМолекулярная генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота 03. 00. 04 биохимия

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU