Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота icon

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота





Скачать 273.19 Kb.
НазваниеЛобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота
Т.Н. Грязнева
Дата конвертации23.05.2013
Размер273.19 Kb.
ТипАвтореферат
На правах рукописи


ЛОБОВА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА


Усовершенствование лабораторной диагностики

аденовирусной инфекции крупного рогатого скота


16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология


А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва - 2006


Работа выполнена в Федеральном государственном образователь­ном учреждении высшего профессионального образования «Москов-ская государственная академия ветеринарной медицины и биотехно­логии имени К.И.Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ)


Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор,

Заслуженный работник высшей школы РФ,

Лауреат премии правительства РФ

Белоусова Раиса Васильевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Соколова Надежда Львовна;

доктор биологических наук, профессор

Грачев Виктор Павлович


Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический ин­ститут биологической промышленности» (ВНИТИБП).


Защита состоится «____» июня 2006 г. в 10.00 часов на заседа­нии диссертационного совета Д 220.04.01 в Федеративном государ­ственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23). Тел. (095) 377-93-83).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.


Автореферат разослан «____» мая 2006 года


Ученый секретарь

диссертационного совета Т.Н. Грязнева


ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Развитие промышленного животноводства, требующее создания производственных комплексов, обострило про­блему респираторно-кишечной патологии крупного рогатого скота (КРС) в хозяйствах РФ. Наиболее актуальными явля­ются забо­левания, вызываемые вирусами парагриппа-3, инфекци­онного ринотрахеита, вирусной диареи и др. К их числу относятся и аденовирусы.

По данным МЭБ аденовирусную инфекцию (АВИ) более 40 лет реги­стрируют во многих странах мира (Англии, США, Венгрии, Болгарии, Голландии, Канаде, Австрии и др.). Первые сообщения о не­благополучии хозяйств в отношении АВИ в СССР поя­вились в конце 60-х годов (Алиева Н.А., 1967; Гуненков В.В. и др., 1969). Но до сегодняшнего дня в нашей стране роль аденовирусов в респираторно-ки­шечной патологии у КРС и вопросы цир­куляции раз­личных серотипов возбудителя изучены недостаточно. Аденовирусную инфекцию диагностируют преимущественно у молодняка КРС, она ха­рактеризуется острым течением, поражение органов дыхания, пищева­рения, конъюнктивитом. У взрослых животных инфек­ция протекает бес­симптомно. Уста­новлено, что аденовирусы являются иммунодепрессан­тами и способ­ствуют развитию вторичной инфекции. Клинико-эпизо­отологическая диагностика АВИ КРС затруднена из-за сходства с дру­гими заболеваниями, поэтому главная роль отводится лабораторной ди­агностике. Она основана на: - выделении аденовирусов из патоло­гического материала в первичных культурах клеток тестикул бычка (ТБ), почки эмбриона коровы (ПЭК), легких эмбриона коровы (ЛЭК). Однако, методика получения первичных культур клеток трудоемкая. В связи с этим подбор универсальной перевиваемой культуры клеток является актуальной задачей; - идентификации выделенных изолятов в реакции преципитации (РДП), реакции иммунофлуоресценции (РИФ), реакции связывания ком­племента (РСК), электронной микроскопии. Однако эти методы дают ответ на вопрос лишь о принадлежности выделенных изолятов к той или иной антигенной подгруппе, или к семейству аденовирусов. Созда­ние же системы типовой идентификации является перспективным на­правлением; - ретроспективной диагностике, исследование парных проб сыворотки крови в серологи­ческих реакциях РНГА, ИФА, РН. Два последних метода, из-за их высо­кой себестоимости, практически не применяются.

Реакция непрямой гемагглютинации используется для диагно­стики аденовирусной инфекции в России на протяжении более чем 15 лет. Единственным и существенным недостатком РНГА является то, что в качестве носителя для антигенов используются эритроциты ба­рана, ко­торые трудно поддаются контролю. При этом длительность хранения таких препаратов не превышает шести месяцев. Актуальным является замена биологических носителей на синтетические, полимер­ные микро­сферы, которые могут быть охарактеризованы по заряду, хи­мическому строению, диаметру, распределению частиц по размеру и сохраняют стабильные свойства от партии к партии. Они используются для созда­ния латексных диагностикумов.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изуче­ние распространения аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в некоторых регионах России и усовершенствование её лабораторной диагностики.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить сле­дующие задачи:

1. Изучить распространение аденовирусной инфекции крупного рога­того скота в некоторых регионах России.

2. Провести скрининг культур клеток, чувствительных к аденовиру­сам двух подгрупп и определить эффективный способ культивирования для крупномасштабного получения вируссодержащего материала.

3. Повысить инфекционную активность эталонных штаммов аденови­ру­сов крупного рогатого скота для создания коллекции референс-штам­мов.

4. Получить гипериммунные сыворотки к гексону аденовируса на ос­нове оптимизированной схемы иммунизации животных.

5. Разработать условия проведения реакции латекс - агглютинации на основе полученных реагентов.

6. Определить диагностическую ценность и апробировать тест-сис­тему реакции латекс - агглютинации для выявления антител к аденови­русам крупного рогатого скота в пробах сывороток крови, полученных от спонтанно инфицированных и вакцинированных животных.

Научная новизна. Изучено распространение аденовирусной инфек­ции в некоторых регионах России, в том числе и Московской области за период 1998-2003 г. Полученная коллекция эталонных штаммов адено­вирусов крупного рогатого скота с высоким инфекционным титром 6,5-9,5 ТЦД50 /МЛ, позволяет идентифицировать антитела к аденовирусам в сыворотке крови КРС в РН, РЗГА.

Получена коллекция эталонных штаммов аденовирусов крупного ро­гатого скота (с первого по десятый серотип) с высокими инфекцион­ными титрами.

Разработан крупно­масштабный способ получения аденовируса на культуре клеток T-1, выращенной на микроносителях (А.с. № 1540070 СССР). Впервые рекомендована единая перевиваемая линия клеток Т-1 для культивиро­вания аденовирусов КРС как I, так и II антигенных под­групп.

Отрабо­тан способ суспензионного культивирования на перевиваемой линии МDВК аденовирусов I подгруппы. Отработан метод постановки реак­ции нейтрализации для серодиагностики аденовирусной инфекции КРС микрометодом (рационализаторское предложение № 150 от 05.06.89г). Разработан способ получения латексного диагностикума для постановки реакции латекс - агглютинации (патент РФ №2004121606/15 (023348) от 15.07.2004г).

Впервые в качестве антигенов в методе РЛА для выявле­ния специ­фических антител в крови крупного рогатого скота использо­ван струк­турный белок гексон аденовируса Bovine - 10. Оптимизиро­вана схема получения гипериммунных сывороток к гексону аденови­руса Bovine – 10 на кроликах, для использования в качестве референс-сывороток. Раз­работана технология производства РЛА-диагностикума для обнаруже­ния антител против аденовирусов КРС.

Практическая значимость. Усовершенствован метод серодиагно­стики аденовирусной инфекции КРС в РНГА (А.с «Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума» № 1774540 от 8 июля 1992 г). Предложена единая перевиваемая культура клеток Т-1 для выделения и культивирования аденовирусов КРС.

Разработан «Способ постановки реакции нейтрализации для сероди­агностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота микроме­тодом», рационализатор­ское предложение № 150 от 05.06.89 г. Разрабо­тан «Способ очистки аденовирусов крупного рогатого скота», рациона­лизаторское предложе­ние № 159 от 18.09.1989 г. Разработан и утвер­ждён в установленном порядке Главным управлением ветеринарии МСХ РФ 21 января 2004 г. «Набор эритроцитарных диагностикумов для серодиагностики ин­фекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), вирусной диа­реи (ВД), аденовирусной (АДЕНО), респираторно-синцитиальной (РС) инфекций и хламидиоза крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)», который удостоен золо­той медали ВДНХ в 2005 году. Разработан способ получения латексного диагностикума для вы­явления антител к аденовирусам КРС (патент №2004121606/15 (023348) от 15.07.2004г). Разработано «Временное на­ставление по применению набора РЛА–диагностикума для серодиагно­стики аденовирусной ин­фекции крупного рогатого скота». Разработаны «Технические условия набора РЛА - диагностикума для серодиагно­стики аденовирусной ин­фекции крупного рогатого скота».

Апробация результатов диссертации. Результаты работы доложены и обсуждены на научно-производственной конференции молодых уче­ных ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2002), III Международной Россий­ско-Иран­ской конференции «Сельское хозяйство и природные ресурсы» (Мо­сква, 2003), научно-производственной конференции, посвященной 100-летию профессора Н.Г. Кондюрина «Актуальные вопросы микро­биологии и инфекционной патологии» (Омск, 2004), научно-производ­ственной международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных, биологиче­ских препаратов» (Щел­ково, 2004), на межкафедральном совещании профессор­ско - преподава­тельского состава ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2006).

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Широта распространения аденовирусной инфекции крупного рога­того скота в некоторых регионах России.

2. Создание коллекции референс - штаммов аденовирусов КРС с вы­со­ким инфекционным титром.

3. Скрининг культур клеток, чувствительных к аденовирусам двух под­групп и способов крупномасштабного получения вируссодержащего материала.

4. Получение гипериммунных сывороток крови к гексону аденовиру­сов на основе оптимизированной схемы иммунизации животных.

5. Технология разработки РЛА для выявления антител к аденовиру­сам крупного рогатого скота на основе получения высокоактивных ви­руссо­держащих клеточных суспензий, специфических антигенов-гексо-нов и гипериммунных сывороток.

6. Оптимизация условий проведения РЛА по выявлению антител к аде­новирусам крупного рогатого скота.

7. Результаты апробации разработанной тест-системы РЛА в экспери­ментальных и производственных условиях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, получено 3 авторских свидетельства, 1 патент и 2 рационализа­торских предложения.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изло­жены на 130 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, соб­ственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практиче­ские предложения, список использованной литературы (158 источников, из которых 76 отечественных и 82 иностранных). Работа содержит 16 таблиц, 16 рисунков и 6 страниц приложений.

Собственные исследования


Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 1989 по 2006 годы на кафедре ветери­нарной вирусологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ и ФГУ «Центральная на­учно-методическая ветеринарная лаборатория».


При изучении эпизоотической ситуации по некоторым вирус­ным за­болеваниям использовали данные отчетов государственных ве­теринар­ных служб РФ и результаты собственных ис­следований, проведенных в неблагополучных хозяйствах Московской области от животных с респираторно-кишечным синдромом,исследовали парные пробы сывороток.

В работе использовали штаммы аденовиру­сов Вovine-10 серотип 1, Вovine-19 серотип 2, WBR-1 серотип 3 (первая антигенная подгруппа), ТНТ-62 серотип 4, В/ 65 серотип 5, 671/130 серотип 6, Fucuroi серотип 7, Misk/67 серотип 8, Sofia 4/67 серо­тип 9, Stendhal cеротип 10 (вторая ан­тигенная подгруппа), КЛБ се­ротип 1, Русь 18/81 серотип 7- два полевых изолята, депонированные в коллекции ВГНКИ и имеющие регистраци­онные номера как вакцин­ные штаммы № 30 и № 31 от 04.12.85 г. и 06.06.86 г. При изучении культуральных свойств штаммов аденовирусов крупного рогатого скота использовали первичные и перевиваемые куль­туры клеток: ТБ, ПЭК, МДБК, ЛЕК, ППЭК Таurus-1 (Т-1), Таurus-2 (T-2), Таurus - 4 (T-4).

В качестве ростовых сред для первичных и перевиваемых куль­тур клеток использовали общепринятые в вирусологии питательные среды в соотношениях, оптимальных для каждой из культур клеток.

Применяли три метода культивирования – стационарный, суспензи­онный и метод выращивания культуры клеток на микроноси­телях Ци­толар – 3 (НПО «Биолар», г. Рига).

Инфекционную активность полученных вирусов определяли путём титрования в чувствительных культурах клеток, выражая титр вируса в Lg TЦД 50/ см3, по общепринятой методике Reed и Mench (1938).

Клонирование аденовирусов проводили по методу бляшек.

Выделение и очистку аденовирусных белков-гексонов из куль­тураль­ной вируссодержащей суспензии проводили методом двухэтап­ной хро­матографии (гидрофобной и анионообменной) в модификации Хилько С.Н. с соавтор. (1986). Чистоту препаратов гексонов оценивали методом электрофореза в ПААГ в буферной системе Леммли (1970).

Для получения специфических сывороток использовали куль­тураль-ную вируссодержащую жидкость с активностью 9,0 ± 0,5 Lg ТЦД 50/ см3 и гексон того же вируса в концентрации 0,2 мг/мл и 0,5 мг/ мл. Активность полученных сывороток крови определяли в РН, РНГА и РЛА.

Использовали полимерные микросферы для получения конъю­гатов для РЛА – сополимерную суспензию стирола и стиролсульфо­ната на­трия (ПСТ-ССН) с диаметром частиц 1,15 мкм, с величиной потенциала - 44,4 мВ и стирол – акролеиновую (ПСТ-АК) с диаметром частиц, рав­ным 1,7 мкм, с величиной потенциала -52,4 мВ.

Серологические реакции проводили: РН - по стандартной методике микрометодом с постоян­ной дозой вируса (100 TЦД50/см3 ) и двукрат­ными разведениями сыво­роток; РНГА - микрометодом по стандартной методике с набором эритроцитарных диагностикумов для серодиагно­стики ин­фекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), вирус­ной диа­реи (ВД), аденовирусной (Адено), респираторно-синцитиальной (РС) инфекций и хламидиоза КРС (ТУ 93886100049295404); РДП - со­гласно общепринятой методике. В качестве ис­пытуемых проб биологи­ческого материала (n=1807) использовали сыворотки крови КРС, полу­ченных из хозяйств Московской области.

Статистическую обра­ботку результатов проводили общепринятыми методами с использова­нием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятности Стьюдента-Фишера в зависимости от объёма анализируемого материала. В качестве достоверного интер­вала был выбран уровень вероятности Р=0,95 (уро­вень значимости р<0,05 ).


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение распространения аденовирусной инфекции

крупного рогатого скота в некоторых регионах России

Для определения этиологической роли некоторых вирусов в респи­раторно-кишечной патологии КРС в хозяйст­вах РФ нами была проана­лизирована официальная отчетность за 1998 - 2003 гг ветеринарных служб административных единиц РФ по форме 4-Вет.

За анализируемый период исследовано 13360 животных на аденови­русную инфекцию, в 826 (6,0 %) случаях установлен положительный диагноз. Количе­ство заболевших телят аденовирусной инфекцией на протяжении пяти лет возросло с 3,0% в 1998 г до 12, 4% в 2002 г. Этот факт говорит о важной роли данной инфекции в структуре респираторно- кишечной па­тологии крупного рогатого скота в хозяйствах РФ.

Изучение роли аденовируса крупного рогатого скота в

хозяйствах Московской области за период 1998-2003 гг.


Роль аденовируса в респираторно-кишечной патологии телят в хо­зяйствах Московской области изучали в период 1998-2003 годы. Для этого исследовали парные и одиночные пробы сывороток крови. Прово­дили дифференциальную диагностику с помощью набора для серодиаг­ностики инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), ви­русной диареи (ВД), аденовирусной (Адено), респираторно-синцити-альной (PC) инфекций методом РНГА. На адено­вирусную инфекцию было исследовано 783 животных, выявлено серопози­тивных 143 (14%).

Заболевание аденовирусной инфекцией, как правило, регистрировали в ассоциации с вирусом ВД, реже с ПГ-3, РС. Самый высокий уровень заболеваемости аденовирусной инфекцией в хозяйст­вах Московской об­ласти по нашим исследованиям отмечали в 2002 г (15 %), который ко­лебался в пределах от 6,8 % до 15,0%.. Из 108 обследованных хозяйств во всех случаях установлена цир­куляция вирусов ПГ-3 в 100% , ИРТ 63,8 %, вируса ВД 38,8 %, аденовируса - 36,2 %, вируса РС - 4,6% хозяйств.

Таким образом, при изучении этиологической структуры респира­торно-кишечной патологии в хозяйствах РФ и Московской области нами раскрыта существенная роль вирусов ПГ-3, ИРТ. Вспышки аде­новирусной инфекции ежегодно регистрируются в тех регионах, где проводится лабораторная диагностика данного заболевания. Учитывая отсутствие специфической профилактики аденовирусной инфекции, мы прогнозируем осложнение эпизоотической ситуации в даль­нейшем.

Скрининг клеточных культур, чувствительных к

аденовирусам крупного рогатого скота


В диагностике аденовирусной инфекции основную роль играет лабо­ра­торная диагностика. Единственной чувствительной системой для ре­продукции аденовирусов является культура клеток. Ветеринарные лабо­ратории РФ используют для диагностики АВИ крупного рогатого скота дорогостоящие первичную культуру клеток и в низком диапазоне чув­ствительности перевиваемые культуры клеток, что в современных усло­виях не экономично и малоэффективно.

В нашу задачу входило подобрать единую, высокочувствитель­ную, надежную перевиваемую культуру клеток, как для первой, так и для второй подгруппы аденовирусов КРС и пред­ложить ее ветеринарной практике. Для этого использовали штаммы аде­новирусов Вovine -10 се­ротип 1, Вovine-19 серотип 2, WBR-1 серотип 3 (первая антигенная под­группа), ТНТ-62 –серотип 4, В/65 серотип 5, 671/130 серотип 6, Fucuroi серотип 7, Misk/67 серотип 8, Sofia 4/67 серотип 9, Stendhal cеротип 10 (вторая антигенная подгруппа) и культивировали их в первичных ТБ (тестикулы бычка), ЛЭК (лёгкое эмбриона коровы), ПЭК (почка эм­бриона коровы) и в перевиваемых культурах клеток почки теленка Тау­рус-1 (фибробластоподобный клон), в двух эпителиоподобных клонах Т-2,Т- 4 , ППЭК (почка эмбриона ко­ровы), ТР (трахея коровы), ПТ- 80 (почка теленка), MDBК (почка эм­бриона теленка).

В результате проведённых исследований установлено, что все эта­лонные штаммы аденовирусов (с 1 по 10 серотип) репродуцировались в перевиваемой культуре клеток Таурус-1. Перевиваемые культуры кле­ток Т-2,Т-4 оказались чувствительны лишь к аденовирусам первой анти­генной подгруппы. Полученные данные характеризуют перевивае­мую культуру клеток Таурус-1 как единую, чувствительную систему, позво­ляющую использовать её в диагностике АВИ крупного рогатого скота в ветеринарных лабораториях РФ, и рекомендовать её в качестве суб­страта для изготовления вирусных препаратов.

Клонирование аденовирусов крупного рогатого скота


На следующем этапе работы решалась задача повышения инфекци­онной активности аденовирусов КРС. Кол­лекция эталонных штаммов аденовирусов КРС с 1-10 серотип была получена от доктора Barta А. из Венгрии. Аде­новирусы крупного рогатого скота культивировались в известных куль­турах клеток в очень низких инфекционных титрах от 1,5-3,5 Lg ТЦД50/мл. С целью повышения инфекционного титра мы ис­пользовали метод клонирования вируса в культуре клеток Т-1 под ага­ровым покрытием (метод бляшек).

В результате. были получены вирусы с инфекцион­ным титром от 6,5 lg ТЦД50/ мл до 9,5 lg ТЦД50/ мл. Высокий инфекционный титр позволял получить “урожай” вирусов уже через 48 часов после за­ражения, что сокращало сроки культивирования на 10 суток .

В итоге проведенной работы была получена коллекция аденовиру­сов с высоким инфекционным титром.


Культивирование аденовируса в культуре клеток Т-1, выращенной на микроносителях « Цитолар»


Последующие исследования были направлены на выбор способов культивирова­ния перевиваемых культур клеток для репродукции адено­вирусов, при которых в корот­кие сроки можно получить накопление ви­руса с высокой инфекционной активностью, в больших объёмах, при одновременной экономии питательных сред, сывороток, сокра­щении сроков эксплуатации оборудования. Используя мировой опыт в области выращи­вания клеток на микроносителях и в суспензии, мы применили данные способы культи­вирования для крупномасштабного накопления аденовирусов. Нами разработан способ выращивания перевиваемой культуры Т-1 на микроносителях (МН) «Цитолар-3». Были проведены эксперименты на пригодность МН по важным характеристикам: токсич­ность, равномерность распределения клеток на МН при посеве, равно­мерность распре­деления по объёму культиватора в процессе выращива­ния клеток, возможность прове­дения визуального контроля условий культивирования и роста клеток. Оптимизирована посевная концентра­ция клеток на заданную площадь микроносителя 10 мл (1 мл МН со­ставляет около 150 см2), для формирования монослоя через 72 часа.

Оптимальная посевная концентрация клеток на 1 мл микроносителя соста­вила 0,4. 106. При этом полный монослой на МН формировался на третьи сутки с высокой концентрацией клеток в 1 мл- 1,6. 10 7 и коэффи­циентом прироста 4,0. При накоплении аденовируса в перевиваемой культуре клеток Т-1, выращенной на МН, время макси­мальной репро­дукции вируса сокращалась в два раза, а инфекционная активность уве­личивалась и составляла 8,5-9,5 Lg ТЦД50/мл. При стационарном способе культивиро­вания максимальный инфекционный титр вируса регистри­ровали через 96 часов после начала культивирования, он составлял 4,8 Lg ТЦД50/мл .

Таким образом, предлагаемый способ получения аденовируса с ис­пользованием культуры клеток Т-1, выращенной на микроносителях, позволяет получить аденовирус в нужных объёмах и с высоким инфек­ционным титром.

Культивирование аденовируса первого типа в суспензионной

культуре клеток MDBK

Ещё один способ культивирования вирусов для производства диаг­ностикумов и вакцин основан на культивировании вирусов в суспензи­онной культуре клеток.

Мы поставили задачу выяснить возможность использования переви­ваемой линии клеток MDBK для суспензионного культивирования с це­лью репродукции в ней адено­вируса крупного рогатого скота – Bovine - 10. Культура клеток Т-1 оказалась строго субстрат-зависимой. В пред­варительных опытах, после адаптации культуры клеток MDBK к сус­пензионному росту, логарифмическая фаза роста наступала через 14 дней после начала культивирования. Данную популяцию клеток брали в качестве расплодки с концентрацией клеток 400000 клеток в 1,0 мл в ко­личестве 250 мл и помещали в колбу “Bellco”( США), объёмом 1,0 л.

Вирус культивировали при 37оС при посто­янном перемешива­нии 16-20 об/мин. Для определения сроков оптимального накопле­ния вируса была изучена кривая репродукции в суспензионной культуре клеток. Были отобраны пробы вируса для титрования через 24,48,60,96 часов. Установлено, что мак­симальную продукцию вируса наблюдали через 60 часов. К этому сроку инфекционный титр вируса достигал 8,5-9,5 Lg ТЦД50/мл. Данный способ предлагается для культиви­рования аде­новирусов крупного рогатого скота с целью получения вируссодержа­щей суспензии в больших объемах.


Получение реагентов набора РЛА


В задачу разработки иммунохимических реагентов набора РЛА вхо­дило изучение и получение:

- очищенных антигенов аденовируса первого типа Bovine – 10;

- положительной сыворотки крови;

- отрицательной сыворотки крови;

- латексных микросфер, с заданными характеристиками.

Получение аденовирусных антигенов. По данным литературы на­личие в составе гексона аденовирусов первой антигенной подгруппы перекрёстно реагирующих антигенных детерминант самой широкой специ­фичности явилось основанием для создания универсального диаг­ностикума.

В каче­стве антигена нами был выбран аденовирус Bovine – 10. Так как при репродукции данного вируса помимо получения высо­кого ин­фекционного титра 9,5 Lg ТЦД50/мл образуется большое количе­ство гексона (в среднем 5,0 мг гексона с 5,0 литров культурального ви­руса). Это свойство сохранялось и после клонирования данного вируса. В результате использования данной методики нами получен гексон аденовируса Bovine – 10 95 %-ной очисткой. Иммунохимическую актив­ность и специфичность получен­ного антигена проверяли после иммуни­зации кроликов для получения гипериммунных сывороток и иммобили­зации гексона на латексные микросферы.

Получение гипериммунных сывороток к гексону аденовируса первого серотипа Вovine-10. Основными задачами в нашей работе были - совершенствование известной схемы иммунизации на основе ис­пользования в качестве иммуногена очищенного пре­парата - гексона аденовируса Вovine -10 и сочетание последовательных внутрикожных и внутривенных введений с интервалом в две- три недели. Продолжитель­ность всего цикла составила 160 дней. В качестве продуцентов сыво­ротки крови мы использовали кроликов породы шиншилла массой 2,5 – 3 кг. В качестве иммуногенов служили: штамм аденовируса Вovine-10, накопленный в культуре клеток Т-1, с активностью 9,5 Lg ТЦД50/мл и гексон того же вируса. Для отработки оптимальной дозы для им­муниза­ции брали две концентрации гексона (0,2 и 0,5 мг/ мл). Полученные сы­во­ротки исследовали в РН, РНГА, РЛА.

Наиболее высокие титры антител в реакциях РН, РНГА, РЛА (8,5± 0,16; 10,5±0,25 и 11,2±0,3 log2 соответственно) получены у животных вто­рой группы, где в качестве им­муногена использовали гексон в концен­трации 0,2 мг/мл, что позволяло получать ак­тивные, специфичные сыво­ротки с длительным сроком хранения.

Получение конъюгатов для постановки РЛА. На первых этапах работы нами был проведён скрининг ПМ (более 10 вариантов) с раз­ными химическими характеристиками и свойствами. Из всего многооб­разия в качестве носителей биолигандов (антигенов) были выбраны два вида полимерных микросфер, которые отвечали требованиям, предъявляемым к полимерным носите­лям биолигандов, используемым в РЛА:

1. Узкое распределение по размерам, что делает возможным опреде­лить площадь поверхности носителя.

2. Содержание на ПМ функциональных групп для ковалентного свя­зывания с биоли­гандом.

3. Индивидуальность частиц в водной и буферных фазах (контроль на спонтанную агглютинацию в данных системах).

Результаты подбора условий получения диагностикума для РЛА. Иммобилизацию проводили, используя:

- полимерные микросферы (ПСТ-ССН), (ПСТ-АК);

- биолиганды (аденовирус Вovine -10 с инфекционным титром 9,5 Lg ТЦД50/мл);

- гексон аденовирус Вovine -10 в концентрации 0, 2 и 0,5 мг/мл;

- в водной (бидистиллированная вода) и буферной (ФБР) фазе при рН 6,0-6,4; 7,2-7,4 8,2-8,4;

- температурный режим сенсибилизации + 18-20оС ; +4-8оС ; +37оС ;

- режим инкубации 5, 12 и 24 часа.

Установлено, что при иммобилизации ПМ - ПСТ-АК на фосфатно-буферном буфере (рН 8,4) при +4оС в течение 12 часов лучшие резуль­таты по активности и специ­фичности через двенадцать месяцев (срок наблюдения) показывал конъюгат «ПСТ-АК – гексон 0,5 мг/мл » (рис. 1).

Подбор условий постановки РЛА. Для повышения демонстраци­онности реакции нами были использованы раз­личные разбавители, с ко­торыми испытывали конъюгат «ПСТ-АК – гексон 0,5 мг/мл», гиперим­мунные сыворотки к вирусам ПГ- 3, ВД, РС, аденовирусам. Одновре­менно сыворотки крови исследовали в РНГА. В реакции использовали различные варианты разбавителей.

Установлено, что разбавитель, приготовленный на ФБР 7,2-7,4+твин-20 в разведении 1:40000 +1% сыворотки кролика, значительно повышает демонстраци­онность реакции. Отмечалась четкая агглютинация в поло­жительных случаях (++++) с гомологичными, при четких отрицательных результатах (-) с гетерологичными сыво­ротками крови, что является по­казателем, как специфичности, так и активности пред­лагаемой тест-сис­темы.




1. Чувствительность РЛА ПМ (ПСТ- АК) биолиганд гексон

аденеовируса Bovine – 10 в концентрации 0,5 мг/мл


Апробация набора реагентов РЛА


Задачей следующего этапа нашей работы было испытание набора реагентов РЛА с использованием различных образцов сывороток на специфичность, чувствительность, воспроизводимость результатов. Для этого набор реагентов РЛА испытывали с гомоло­гичными и гетероло­гичными сыворотками крови, полученными от разных видов живот­ных, в двух повторах:

- пробы сывороток крови КРС полевые, содержащие антитела к виру­сам ИРТ и ПГ- 3 (2 сыворотки). Сыворотки были исследованы в РН. Титр вируснейтрализующих антител к вирусам ИРТ – 1:32, ПГ-3 -64;

- проба сыворотки специфической, содержащей антитела к хлами­диям, получен­ной из набора флуоресцирующих иммуноглобулинов (се­рия 3, госконтроль 3, дата изго­товления 2005 г., ВНИВИ, г. Казань, ТУ – 10.19.2788), титр в РСК 1:10;

- проба сыворотки крови КРС (полевая), содержащая антитела к ви­русу ВД. Титр вируснейтрализующих антител 1:32;

- сыворотки крови, полученные от 10 крыс, иммунизированных вак­циной против аденовирусной инфекции КРС. Титр вируснейтрализую­щих антител составлял от 1:32 до 1:256;

- сыворотки крови от 10 телят, не принимавших молозиво и не со­держащих анти­тел к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД, РС. Сыворотки проверены в РН;

- пробы сывороток крови кролика, содержащие антитела к аденови­русам первого и седьмого серотипа, полученные из музея кафедры виру­сологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ. Титр вируснейтрализующих антител 1:32 и 1:32 соответственно;

- сыворотки крови от КРС (полевые) в количестве 379 проб, в том числе парные от 10 телят, полученных из 28 хозяйств Московской об­ласти. Сыворотки крови были ис­следованы в РЛА, РНГА, РН.

Как видно из табл. 1, полученный конъюгат с гетерологичными сы­ворот­ками давал отрицательные результаты. Титры антител с гомоло­гичными сыворотками соответствовали 11,0 log2 к первому и 9,0 log2 к седьмому серотипу аденовирусов.

В дальнейшем исследовали пробы сыворотки крови от вакцинированных крыс. Конью­гат для реакции латекс- агглютинации выявлял антитела в титрах от 1:16 до 1:256 у вакцинированных животных , причем эти дан­ные коррелировали с результатами в РНГА и в РН и превышали послед­ние в среднем в четыре раза.


1.Результаты исследования коньюгат для РЛА на специфичность и

чувствительность.


Наименованием сывороток

Титр антител в log2


Гетероло­гичные



против вируса ПГ-3

0

против вируса ИРТ

0

против вируса ВД

0

против Хламидий

0

против вируса РС

0

не содержат антител против

вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД, РС

0

Гомологич­ные

против аденовируса первого серотипа

1-ая антигенная подгруппа


11,0 log2

против аденовируса седьмого серотипа

2-ая антигенная подгруппа


9,0 log2



При исследовании парных проб сыворотки от телят было установ­лено, что конъюгат для РЛА выявлял сероконверсию к аденовирусам с кратностью прироста в четыре и более раз, что коррелировало с результа­тами РНГА и РН.

На следующем этапе провели сравнение результатов исследований сывороток крови КРС в РЛА и РНГА (табл. 2).

2. Сравнительные результаты РЛА и РНГА, полученные при

исследовании полевых проб сыворотки крови крупного рогатого скота



Наимено­вание

реакции

Всего

исследовано

проб

Результаты исследования

положительные

отрицательные

сомнительные

РНГА

379

97

282

0

РЛА

379

96

280

3
При исследовании полевых проб сыворотки установлено, что диагно­стическая чувствительность РЛА по отношению к РНГА составила 98,9%, спе­цифичность и совпадаемость - 99,2%. При этом коэффициент корреляции при исследо­вании положительных и от­рицательных проб составил 0,9.

РЛА: 96 проб положительных, 280 проб отрицательных.

РНГА: 97 проб положительных, 282 пробы отрицательные.

Чувствительность – (96 : 97) х 100 = 98,9 %

Специфичность – (280 : 282) х 100 = 99,2%

Совпадаемость – (96 +280) : 379 х 100 = 99,2%

Таким образом, в результате проведенных исследований получена тест – система РЛА по выявлению антител к аденовирусам крупного рогатого скота, обладающая высокой чувствительностью и специ­фичностью.

ВЫВОДЫ


1. Изучено распространение и установлена этиологическая роль аде­новирусов крупного рогатого скота в некоторых регионах России, про­цент больных животных колебался в пределах от 3,0 % до 12,4 %. В хо­зяйствах Московской области от 6,8 % до 15,0%.

2. Проведен скрининг клеточных культур клеток и способов культи­вирования аденови­русов КРС. Показано, что перевиваемая линия клеток почки теленка Т-1 является еди­ной чувствительной культурой клеток для аденовирусов I и II серологических под­групп. Установлено, что при крупномасштабном получении аденовирусов методами суспензионного культивирования и в клетках, выращенных на микроносителях, их ин­фекционная активность достигает 7,5- 9,5 lg ТЦД50/ мл.

3. Получена коллекция эталонных штаммов аденовирусов десяти се­ротипов (1-10) с высоким инфекционным титром 6,5 – 9,5 lg ТЦД 50 /мл, что позволит идентифицировать антитела к аденовирусам в сыворотках крови КРС в РН, РЗГА.

4. Оптимизирована схема получения гипериммунных сывороток крови на кроликах к гексону аденовируса Вovine-10 для РЛА тест- сис­темы с титром антител 11,8 log 2.

5. Разработаны условия проведения реакции латекс – агглютинации. Впервые в качестве специфических антигенов в тест-системе РЛА по выявлению антител к аденовирусам крупного рогатого скота использо­ваны структурные белки аденовируса – гексоны, ко­торые при иммоби­лизации на полимерные микросферы образуют ковалентную связь с высокой специфичностью и активностью, что позволяет выявлять анти­тела к аденови­русам крупного рогатого скота.

6. Разработан метод выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и вак­цинированных животных. Пока­зана высокая чувствительность и специ­фичность реагентов РЛА. Диагностическим титром антител при адено­вирусной инфекции крупного рогатого скота по результатам исследова­ния сыворотки крови в РЛА следует считать 1: 8 и выше.

7. Установлена чувствительность разработанной тест – системы РЛА по отношению к РНГА, которая составила - 98,9%, специфичность - 99,2% . Результаты РЛА и РНГА совпадали в - 99,2 % случаев, коэффи­циент корреляции составил 0,9.


ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖНИЯ


Материалы исследований по разработке технологии РЛА тест- сис­темы для выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота вошли в следующие (нормативные) документы:

- технические условия по изготовлению и контролю набора для серо­диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота методом РЛА.( Утверждены 12 ап­реля 2006 года, ректором МГАВМиБ им. К.И. Скрябина;

- методические указания по серодиагностике аденовирусной инфек­ции крупного рогатого скота методом РЛА (Утверждены 12 апреля 2006 года, ректором ФГОУ ВПО МГАВМ);

- методические рекомендации по использованию метода гибридиза­ции (с помощью молекулярных зондов) для диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. (Утверждены ГУВ Госагропрома СССР от 30 марта 1989 г.);

- методические указания по серодиагностике аденовирусной инфек­ции крупного рога­того скота методом иммуноферментного анализа (ИФА). Утверждены ГУВ Госагро­прома СССР 18 мая 1989 г.;

- методические указания по серодиагностике аденовирусной инфек­ции крупного рога­того скота в реакции непрямой гемагглютинации (Утверждены ГУВ Госагро­прома СССР 10 апреля 1989 г.);

- ТУ и временные методические указания на набор эритроцитарных диагностикумов для серодиагностики инфекционного ринотрахеита, па­рагриппа-3, вирусной диареи, аденовирусной, респираторно- синцити­альной инфекций и хламидиоза крупного рога­того скота в реакции не­прямой геммаглютинации (Утвержденные ГУВ МСХ РФ 21.01.2004 г).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


1. Носач Л.Н. Изучение антигенного родства аденовирусов человека и крупного рога­того скота методом флуоресцирующих антител /Л.Н.Но-сач, Р.В. Белоусова, Н.П. Вац­нак, Н.С. Дяченко, В.Н. Сюрин, Т.П. Строкова, Л.М. Коленкова //Микробиологиче­ский журнал.- Киев, 1985, С. 67-70.

2. Носач Л.Н. Применение сыворотки к гексону аденовирусов чело­века для обнаруже­ния аденовирусов крупного рогатого скота методом флуоресцирующих антител /Л.Н.Носач, Р.В. Белоусова, Т.П. Строкова // Cб. науч. тр. Ин-та молекулярной биологии и генетики АН УССР, Киев, 1986, с. 78-79.

3. Кругляк В.А. Клонирование фрагментов ДНК аденовирусов круп­ного рогатого скота ВАV-3 в плазмиде риС 19 /В.А. Кругляк, Р.В. Бело­усова, Т.П. Строкова и др. //Доклады ВАСХНИЛ, 1987.- № 11.- С. 41-43.

4. Белоусова Р.В. Культивирование аденовирусов крупного рогатого скота в культуре клеток, выращенной на микроносителях /Р.В Бело­усова, Т.П. Лобова, М.А. Завальный, И.В. Третьякова // Вопросы ветери­нарной биологии: Сб.науч.тр.- М.:МВА, 1988.- С. 85-86.

5. Белоусова Р.В. Культивирование аденовируса первого типа в сус­пензионной культуре клеток /Р.В Белоусова, Т.П. Лобова, Т.И Понама­рева и др. //Интенсификация сель­скохозяйственного производства в условиях ради­кальной экономической реформы: Сб. науч. тр.- Сумы, 1989, с. 169-171.

6. Третьякова И.В. Получение гипериммунных сывороток к некото­рым гексонам адено­вирусов крупного рогатого скота /И.В. Третьякова. Р.В. Белоусова, Т.П. Лобова, и др. //Достижения науки и техники АПК, 1989.- № 1, с. 45-46.

7. Белоусова Р.В. Культивирование ротавируса и вируса инфекцион­ного ринотрахеита крупного рогатого скота в культуре клеток на мик­роносителях /Р.В. Белоусова, В.Н. Муравьев, Т.М. Бабурина, И.В. Третьякова, Т.И. Резова, И.А. Петрова, Т.П. Лобова //Интенсификация сельскохозяйственного производства в условиях радикальной эконо­ми­ческой реформы: Сб.науч.тр.- Сумы, 1989, с .171-172.

8. Белоусова Р.В. Использование иммуноферментного анализа для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота /Р.В.Белоусова, И.В. Третьякова, Т.П. Лобова и др. //Ветеринария, 1989, № 8, с. 28.

9. Кругляк В.А. Структурный анализ ДНК аденовирусов крупного ро­гатого скота /В.А. Кругляк, Р.В. Белоусова, Т.П. Лобова и др. //Вестник сельскохозяйственной науки, 1989.- № 12, с. 148.

10. Лобова Т.П. Применение фильтрационно-хроматографического метода для очистки аденовирусов /Т.П. Лобова, Р.В.Белоусова, В.П. Копенкин и др. //Рац. предложение № 159 от 18.09. 1989 г.

11. Лобова Т.П.Способ постановки реакции нейтрализации для серо­диагностики адено­вирусной инфекции крупного рогатого скота микро­методом. /Т.П. Лобова, Р.В. Бело­усова. //Рац. предложе­ние № 150 от 05.08. 1989 г.

12. Лобова Т.П. Способ выращивания вирусов – возбудителей респи­раторных и кишеч­ных заболеваний крупного рогатого скота /Т.П. Ло­бова, Р.В. Белоусова, В.Н. Сюрин и др. //Автор­ское свидетель­ство № 1540070 от 1 октября 1989 г.

13. Белоусова Р.В. Способ получения антигена аденовирусов круп­ного рогатого скота /Р.В. Белоусова Л.Л. Миронова, Н.К. Преображен­ская, Л.Н. Носач, Т.П. Лобова //Авторское свидетельство № 1632973 8 ноября 1990 г.

14. Белоусова Р.В. Применение фильтрационно -хроматографиче­ского метода для очи­стки аденовирусов //Р.В. Белоусова, Т.П. Лобова, В.П. Копенкин и др. //Ветеринария, 1990, № 11, с. 53.

15. Белоусова Р.В. Экспериментальная аденовирусная инфекция ин­фекция у телят /Р.В. Белоусова, А.Е. Копенкин, В.И. Корольков, Т.П. Лобова //Использование физических и биологических факторов в вете­ринарии и животноводстве: Сб.науч.тр.- Витебск, 1992, с. 102.

16. Белоусова Р.В. Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума /Р.В. Белоусова, Т.П. Лобова, В.С. Фролов, А.Е. Копен­кин //Авторское свидетельство № 1774540 от 8 июля 1992 г.

17. Красота А.Ю. Комплексный мониторинг эпизоотической ситуа­ции по респира­торно-кишечной патологии крупного рогатого скота в хозяйствах Московской области /А.Ю. Красота, Т.П. Лобова, С.В. Вах­рушев и др. // The 3 rd International LRAN and RASSIA Conference. Agriculture аnd Natural Resoures. Abstracts. /M. MTAA- 2002- C. 137-138.

18. Лобова. Т.П. Использование перевиваемой культуры клеток Тау­рус – 1 в диагно­стике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота /Т.П. Лобова, И.В. Третьякова, Р.В. Белоусова //Актуальные вопросы микробиологии и инфекционной па­тологии животных: Сб.науч.тр.-Омск, 2004- с. 395-400.

19. Белоусова. Р.В. Способ получения латексного диагностикума для постановки реак­ции латекс-агглютинации /Р.В. Белоусова, Т.П. Лобова, И.А. Грицкова и др. /Патент № 2004121606/15 (023348).



Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconУСовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconРаспространение инфекционного ринотрахеита и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в центральной сибири

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота icon«Коксиеллез-ассоциированная инфекция крупного рогатого скота и усовершенствование лабораторных методов ее диагностики» 16. 00. 03. ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconОценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconУтвердить план оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза на 2011 год (приложение). Постановление подлежит официальному опубликованию
Ростовской области от 12. 05. 2005 №315-зс «Об областной целевой программе оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза на 2005...

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconОсобенности лейкоза крупного рогатого скота и современные методы его диагностики

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconЭпизоотологическое обоснование и экономическая эффективность рациональной дифференциальной диагностики туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота 16.

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconДиагностика ротавирусной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах омской области

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconУдк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота

Лобова татьяна петровна усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота iconИммунобиологические свойства хламидий, разработка и усовершенствование средств лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов сельскохозяйственных животных 03.

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU