Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология icon

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология





НазваниеПолучение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология
страница1/4
Агафонов Александр Петрович
Дата конвертации31.05.2013
Размер0.75 Mb.
ТипАвтореферат диссертации
  1   2   3   4
На правах рукописи


Агафонов Александр Петрович


Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций


03.01.06 – биотехнология

03.02.02 - вирусология


Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук


Новосибирск, 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный консультант

доктор медицинских наук,

профессор Дроздов Илья Геннадиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Аликин Юрий Серафимович


доктор медицинских наук,

профессор Носик Дмитрий Николаевич


доктор медицинских наук,

профессор Трунов Александр Николаевич

Ведущая организация

Филиал Федерального Государственного Учреждения

«48 Центрального Научно-Исследовательского Института Министерства Обороны Российской Федерации» – «Вирусологический Центр», Московская область, г. Сергиев Посад-6



Защита состоится « 24 » декабря 2010 г. в______часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»


Автореферат разослан «____»______________2010 г.


Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н. Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность проблемы. Борьба с инфекционными заболеваниями – одна из наиболее актуальных и приоритетных задач современного здравоохранения. Болезни, вызываемые инфекционными агентами, во многих странах являются главной причиной преждевременной смерти. Смертность от инфекционных заболеваний характерна, главным образом, для населения развивающихся стран, однако и в странах с высоким уровнем здравоохранения мероприятия по снижению уровня инфекционных заболеваний входят во все национальные программы социальной и медицинской направленности (WHO, 2008; WHO, 2009).

Реализация программы искоренения натуральной оспы, успехи в борьбе с полиомиелитом и корью доказывают возможность эффективной борьбы и даже полной элиминации инфекционного заболевания. Проверенный практикой комплексный подход, включающий в себя сочетание профилактики и эпидемиологического контроля, становится условием борьбы с инфекционным заболеванием и залогом успеха. При этом крайне важно на первых этапах исследования получить сам этиологический агент и его антигенные компоненты и изучить их структурно функциональные и иммунобиологические свойства.

На сегодняшний день корь, наряду с малярией, туберкулезом, ВИЧ/СПИД, холерой, эпидемическим паротитом, краснухой, остается наиболее распространенным инфекционным заболеванием в мире (WHO, 2008; WHO, 2009). Программой ВОЗ определена задача усиления надзора над заболеванием и ликвидации кори.

Приказами МЗ РФ от 19.08.2002 № 270 «Об утверждении программы ликвидации кори на территории Российской Федерации к 2010 году» 21.03.2003 № 117 «О реализации "Программы ликвидации кори в Российской Федерации к 2010 году"» в рамках программы ВОЗ усиления надзора над заболеванием и ликвидации кори была принята национальная программа элиминации кори. Для ее успешной реализации организованы работы по молекулярно-эпидемиологическому мониторингу за инфекцией и разрабатываются эффективные тест-системы для подтверждения случаев заболевания и серомониторинга кори в России. В 2009 заболеваемость корью в РФ снизилась до уровня менее 1 случая на 1 млн. населения, что позволило 2010 году завершить национальную Программу ликвидации кори, и начать процедуру подготовки сертификации территорий для документального подтверждения статуса субъектов РФ как территорий, свободных от эндемичной кори (Гос. доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в РФ в 2009 году», 2010; Приказ Роспотребнадзора №308, 2010).

С одной стороны это подтверждает эффективность мероприятий вакцинопрофилактики в борьбе с инфекциями, с другой – указывает на незащищенность населения от других вирусных инфекций, средства профилактики для которых еще не разработаны. Неконтролируемые инфекции представляют биологическую опасность для России и с точки зрения возможного завоза на территорию эндемичных вирусов при расширяющихся экономических и туристических связях в мире, и с точки зрения умышленного использования инфекционного агента. Особую опасность для человека из-за своей высокой контагиозности и патогенности представляют возбудители вирусных геморрагических лихорадок. Вирусы, вызывающие заболевания с геморрагическим синдромом, относятся главным образом к четырем семействам: Filoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae и Flaviviridae. К наиболее опасным, с точки зрения последствий для не эндемичных территорий, можно отнести представителей семейства Filoviridaeвирусы Марбург и Эбола, летальность от которых составляет 80-90 %. Если учесть увеличение скорости передвижение людей, использующих современные виды транспорта, расширяющиеся связи между государствами, а также высокую контагиозность вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки, то опасность заноса инфекции на не эндемичные территории и возникновение там вспышек с серьезными последствиями становится вполне реальной. Следует учитывать, что для многих возбудителей геморрагических лихорадок четко не определены ни ареалы распространения, ни резервуары инфекции, ни переносчики и способ передачи. В настоящее время для борьбы с этими инфекциями не разработаны эффективные средства профилактики и лечения.

Цель работы  получение вирусных антигенов и изучение их иммунобиологических свойств для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций: геморрагической лихорадки Марбург, кори и эпидемического паротита.

Задачи исследования:

  1. Разработка технологии получения очищенных вирусов из культуральной вируссодержащей жидкости с целью получения антигенов для изучения иммуногенных свойств или разработки современных ИФА-тест-систем в соответствии с принципами обеспечения биологической безопасности в вирусологических лабораториях.

  2. Получение антигенов вируса Марбург, изучение их иммуногенных и протективных свойств и определения антигенов, перспективных для создания вакцины против геморрагической лихорадки Марбург.

  3. Оценка перспективности современных подходов к созданию профилактических препаратов против кори – изучение иммуногенности экспериментального препарата на основе живого вируса кори при пероральном его применении и ДНК-вакцины.

  4. Выделение и изучение циркулирующих на территории России вирусов кори и паротита с целью слежения за их антигенной и генетической изменчивостью и создания на их основе диагностических ИФА-тест-систем.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработана и запатентована технология получения вирусных антигенов для создания профилактических и диагностических препаратов (патенты RU2029561C1, RU2230785C2, RU2348691C1). Получены и охарактеризованы по иммуногенным и протективным свойствам структурные белки вируса Марбург, которые могут быть использованы при разработке диагностических и профилактических препаратов против геморрагической лихорадки Марбург. Показана принципиальная возможность создания удобного в применении и более простого с точки зрения организации профилактических мероприятий варианта коревой вакцины – препарата для перорального применения. В рамках реализации программы глобальной ликвидации кори разработаны эффективные ИФА-тест-системы для диагностики кори и проведения мероприятий по серомониторингу заболевания, а также изучены антигенные свойства циркулирующих на территории Западной Сибири генотипов вируса. Впервые в РФ разработана и внедрена в практику здравоохранения тест-система иммуноферментная для определения антител класса G к вирусу кори, позволяющая оценить содержание антител класса G в международных единицах. Впервые в РФ разработана тест-система иммуноферментная для определения антител класса М к вирусу кори. Исследования по серомониторингу заболевания позволили выявить возрастные группы населения, наиболее подверженные опасности заболевания корью. Подтверждено генетическое и антигенное родство новых генотипов вируса кори и вируса паротита с вакцинными штаммами, используемыми для программы вакцинопрофилактики этих заболеваний. Впервые показана циркуляция генотипа D6 вируса кори и генотипов C и H вируса паротита на территории РФ.

Штамм Popp вируса Марбург депонирован в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) под номером ГКВ N 946 от 20 января 1993 г. Штамм рекомендован для производства диагностических и вакцинных препаратов. Штаммы вирусов кори и паротита депонированы в коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ Вектор (штамм «НовО/96» вируса кори – VB-04, штамм «Драгун» вируса паротита – VB-05, штамм «ПетроНов» вируса паротита – V-330) и использованы для получения антигена – основного компонента ИФА-тест-системы.

Апробация работы

Результаты исследований были доложены: на международной конференции "Медицина, биотехнология, иммунизация и СПИД" (Ленинград, 1991), международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (Москва, 1992), международной конференции 100-летие вирусологии (Санкт-Петербург, Россия, 1992), IX (Глазго, 1993), X (Иерусалим, 1996), XII (Париж, 2002) международных вирусологических конгрессах, 2-й, 3-й и 4-й международных конференциях «Новые направления в развитии вакцин» (Вена, Австрия, 1995, 1997, 1999 гг.), международной конференции «Вирусы Марбург и Эбола» (Марбург, Германия, 2000), 11-м международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (Канкун, Мексика, 2004), IX международной конференции «Новые технологии в медицине и экологии» (Гурзуф-Ялта, 2001), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003), международной конференции по медико-биологическим исследованиям (Мюнхен, 2004), Азиатском конгрессе по аэрозолям (Гонконг, 2004), VI межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств – участников Содружества Независимых Государств: проблемы биобезопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2006), II и III Российских научных конференциях с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002 и 2006), международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, Республика Казахстан, 2008).

Работа выполнена в 1990–2009 годах в ГНЦ ВБ "Вектор" в рамках научных тем организации и по грантам МНТЦ (1035В, 2168). Работы по оценке иммуногенности живой коревой вакцины при пероральной аппликации были проведены в лаборатории профессора A.D.M.E. Osterhaus (Университет им. Э. Роттердамского, Роттердам, Нидерланды). Изучение штамма НовО/96 вируса кори было проведено в лаборатории кори и краснухи д-ра E. Gerike (Институт им. Р. Коха, Берлин, Германия). Основные положения, выводы и практические предложения диссертации были обсуждены и одобрены на заседании проблемно-тематической комиссии «Эпидемиология, вирусология и диагностика особо опасных вирусных инфекций» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (2010).

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Белок NP вируса Марбург обладает выраженными иммуногенными свойствами и вызывает образование вирусспецифических антител и развитие клеточного иммунитета, формируя протективный иммунный ответ при введении лабораторным животным.

  2. Вакцинный штамм вируса кори способен вызывать формирование специфического гуморального и клеточного иммунного ответа у лабораторных животных при пероральном применении.

  3. Введение лабораторным животным ДНК-вакцины на основе гемагглютинина вируса кори приводит к формированию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа.

  4. Наибольший процент лиц, не имеющих протективных антител к вирусу кори, входит в возрастную категорию населения РФ от 16 до 25 лет.

  5. Циркулирующие на территории РФ в период с 1993 по 2001 гг. вирусы кори и паротита находятся в близком антигеном родстве с вакцинными штаммами, используемыми для программы вакцинопрофилактики.

Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 31 научная статья, в том числе 23 статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации, 3 монографии, 1 методические указания. Получено 4 патента Российской Федерации.

Внедрение результатов исследований

Предложены и апробированы методы получения вирусных антигенов, послужившие основой для разработки средств диагностики в рамках выполнения Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».

Внедрена в практику здравоохранения тест-система иммуноферментная для определения антител класса G к вирусу кори с представлением содержания антител в международных единицах. Совместно с ЗАО «Медико-биологический союз» выпущено и поставлено потребителям 8 серий тест-системы «Корь-IgG-ДС», достаточных для проведения более 80 000 анализов.

Материалы диссертации используются, в том числе и в учебно-образовательном процессе при проведении курсов повышения квалификации специалистов микробиологических лабораторий Министерства здравоохранения и социального развития РФ и Министерства сельского хозяйства РФ на базе в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 334 страницах машинописного текста, включает 46 таблиц и 57 рисунков и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 380 работ отечественных и зарубежных авторов.

Материалы и методы исследований

В работе использовали вирус Марбург (штамм Рорр), полученный из БелНИИЭМ (Минск, Беларусь). В качестве референс-штаммов при работе с вирусом кори был использован штамм Эдмонстон (получен из АТСС, VR-24), при работе с вирусом паротита – штамм Эндерс (получен из АТСС, VR-106). При оценке антигенных свойств выделенных изолятов вирусов кори и паротита использовали вакцинные штаммы Л-16 и Л-3, полученные из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (Москва). В качестве тест-вируса для титрования интерферона использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС), полученный из коллекции штаммов вирусов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).

Использовали клетки Л-68, ДК-58 (диплоидные фибробласты эмбриона человека), К-562 (клетки миелолейкоза человека), СV-1, Vero, GMK (клетки почки обезьяны), клетки комара Aedes aegipty и L-929 (клетки мыши) получены из коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор». В работе использовались питательные среды RPMI-1640, ПС-4, Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов производства ГНЦ ВБ «Вектор».

В исследованиях использовали аутбредных морских свинок (вес 250-300 г), кроликов (вес 1,5-2,5 кг), мышей линии BALB/c (вес 14-18 г), обезьян Macaca mulatta (самцы 5,2-6,6 кг) и Papio hamadrias (самцы 4,8-5,2 кг), полученных из питомника ГНЦ ВБ «Вектор». Животные содержались на стандартном рационе с достаточным количеством воды. Все манипуляции с животными при поведении эксперимента проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством.

Для идентификации вируса Марбург использовали референс-сыворотку (сыворотка реконвалесцента N 700808), которая была получена из CDC (Атланта, США). Анализы по определению уровня специфических антител к вирусу кори стандартизовались относительно международного образца «1st International Standard, 1990, Anti-Measles antibody 66/202, 5 International Units per ampoule». Разработанные тест-системы были сравнены с коммерческими тест-системами, производства ЗАО “Биосервис” (Москва), Wampole (США), Boehringer Mannheim (Германия), Human (Германия). Образцы с известным титром ревматоидного фактора (по латекс-тесту) для панели содержащей и не содержащей антитела класса М к вирусу кори были любезно предоставлены к.б.н. Т.Н. Юнасовой (лаборатория кори, паротита, краснухи и интерферонов, рук. проф. В.Ф. Попов, ГИСК имени Л.А. Тарасевича).

Препараты очищенных вирусов Марбург, кори, паротита анализировали с помощью электронной микроскопии, электрофореза в ПААГ по Лаемли (Laemly W.K, 1970), вестерн-блот анализа (Towbin H. et al., 1976), а концентрацию общего белка в препаратах определяли традиционным методом Лоури (Lowry O. H. et al., 1951).

Оценку показателей гуморального иммунитета проводили: для вируса Марбург методом ИФА по ранее описанной методике (Becker S. et al., 1992), для вируса кори и паротита – методом РТГА, используя эритроциты обезьяны (Попов В.Ф. и др., 1985), методом ИФА, используя коммерческие тест-системы, и в реакции нейтрализации (CDC, 1996). Оценку клеточного звена иммунитета проводили с использованием реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), которую проводили по общепринятой методике (Ignatyev G.M. et al., 1995), методом ELISpot с использованием набора «ELISpot mouse INF-γ» (R&D Systems Inc, США) и исследуя активность CD3, CD4, CD69 и CD8 клеток (Stittelaar K. et al., 2000). Протективные свойства препарата оценивали по индексу резистентности, который вычисляли как разницу логарифмов ЛД50 в опыте и контроле. Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрических методов оценки: сравнение по χ2 критерию, сравнение по U критерию Манна-Уитни (Закс Л., 1976). Значение ЛД50 находили по формуле Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).

Для разработки ИФА-тест-систем использовали выделенные от больных штамм NovO/96 вируса кори (патент RU № 2230785 C2) и штамм Драгун вируса паротита (патент RU 2348691 С1).

Исследования с участием людей проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 Т2288, Федеральные законы №30-ФЗ от 02.03.1998, № 214-ФЗ от 20.12.1999). Порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом IRB00001360.

Результаты исследований И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение препаратов антигенов вируса Марбург и изучение их иммуногенных и протективных свойств. На первом этапе исследования была проведена идентифицикация используемого для получения антигенов штамма Рорр вируса Марбург: показана идентичность мол. весов белков исследуемого вируса белкам вируса Марбург. Показано также, что белок с мол. весом 96 кД реагировал с сывороткой реконвалесцента, переболевшего геморрагической лихорадкой Марбург (рис. 1).



Рис. 1. Электрофоретическое изучение белков вируса Марбург и вестерн-блот-анализ. Дорожка 1– маркер мол. весов, дорожка 2– белки вируса Марбург, дорожка 3– нормальная сыворотка козы, дорожка 4– иммунная сыворотка козы, дорожки 5 и 6 – фракции Ig G козы, дорожка 7– нормальная сыворотка кролика, дорожка 8– иммунная сыворотка кролика, дорожка 9– сыворотка реконвалесцента № 700808.

После этого выбирали культуры клеток для получения препаративных количеств вируса Марбург и определяли сроки сбора КВЖ (таблицы 1 и 2).

Таблица 1

Определение чувствительности культур клеток к вирусу Марбург

Культура клеток

Титр вируса* (lg ЛД50/мл)

GMK

5,80 + 0,60

CV-1

6,17 + 0,62

ДК-58

6,40 + 0,60

Vero

6,67 + 0,62

Л-68

6,16 + 0,61

Клетки комара Aedes aegypti

6,50 + 0,60

* титр вируса определен при внутрибрюшинном заражении морских свинок.

Таблица 2

Динамика накопления вируса Марбург в КВЖ при культивировании на монослойных культурах клеток ДК-58 и Л-68

Срок культивирования (ч)

Титр вируса* (lg ЛД50/мл)/ культура клеток

ДК-58

Л-68

24

2,85 + 0,12

4,92 + 0,27

48

5,19 + 0,15

6,74 + 0,32

72

5,91 + 0.17

7,58 + 0,33

144

6,45 + 0,26

6,16 + 0,41

* титр вируса определен при внутрибрюшинном заражении морских свинок.

Показано, что штамм Рорр вируса Марбург эффективно нарабатывается на использованных культурах клеток. Для дальнейшей работы была выбрана культура Л-68, которая решением ГИСК им. Л.А. Тарасевича от 09.06.87г. была рекомендована как возможный субстрат для производства медицинских иммунобиологических препаратов. Максимальных значений титр вируса достигал на 3-и сут после заражения и составлял 7,58 + 0,33 lg ЛД50/мл. Проверка показала, что после смены питательной среды на 3 сут концентрация вируса в КВЖ на 5-й день вновь достигала высоких значений (7,2 lg ЛД50/мл). После второй смены среды на 5-е сут и сбора КВЖ на 7-е сут вирус накапливается в КВЖ в меньших количествах (6,0 lg ЛД50/мл). Исходя из результатов исследования, дальнейшее накопление вируса проводили на монослое клеток Л-68 с множественностью заражения 0,1 ЛД50/кл., на однолитровых культуральных сосудах, используя двойной слив КВЖ.

Для получения препаратов белков NP и VP40 вируса Марбург использовали хроматографическое (ВГЖХ) фракционирование на колонке с носителем полисил-500-ОДС (рис. 2). Препараты рекомбинантных белков GP и VP24 были любезно предоставлены д-ром S. Becker (Институт вирусологии, Марбург, Германия). В качестве препарата сравнения использован концентрированный очищенный инактивированный вирус Марбург, полученный по технологии, описанной в патенте RU 2029561 С1.

Изучение гуморального ответа на введение препаратов показало, что рекомбинантный белок GP, полученный в бакуловирусной системе, вызывал индукцию специфических антител в наибольших титрах как при иммунизации мышей, так и при иммунизации морских свинок (рис. 3). Специфический клеточный ответ, изучаемый методом РБТЛ, регистрировался у животных только при введении белков NP и GP вируса Марбург. Иммунизация белком NP обеспечивала максимальную защиту морских свинок от введения летальных доз вируса Марбург – коэффициент защиты при введении дозы вируса Марбург 50 ЛД50 равнялся 70+14 %. Для препарата белка VP40 уровень защиты составлял 16+8 %, для препарата белка VP24 – 14+4 %, а для препарата белка GP –26+6 %.



Рис. 2. Профиль элюции белков вируса Марбург (А) и электрофореграммы фракций, выделенных в 12% ПААГ белков NP и VP40 вируса Марбург (Б). Дорожка 1 - фракция, содержащая белок NP, дорожка 2 - фракция, содержащая белки NP и VP40, дорожка 3 - фракция, содержащая VP40, дорожка 4 – электрофорез очищенного вируса Марбург.



Рис. 3. Формирования гуморального ответа у морских свинок после однократного (А) и двукратного на 0 и 14 сут (Б) введения препаратов белков вируса Марбург.

Таблица 3

Изучение протективной активности белков вируса Марбург при введении белка в дозе 20 мкг/ животное и дозе активного вируса Марбург для заражения 50 ЛД50/животное

Препарат белка

Кратность введения

Коэффициент защиты (%)

NP

1-кратно

47+12

2-кратно*

70+14

VP40

1-кратно

0

2-кратно

16+8

VP24

1-кратно

14+4

2-кратно

н.и.**

GP (б)

1-кратно

26+6

2-кратно

н.и.

GP (ВОВ)

1-кратно

0

2-кратно

н.и.

ИАМ

1-кратно

52+10

2-кратно

87+14

Контроль

1-кратно

0

2-кратно

0

* - введение с интервалом 16 сут,

** - не исследовали,

GP (б) - препарат рекомбинантного белка GP, полученный в бакуловирусной системе,

GP (ВОВ) - рекомбинантный белок GP в составе осповакцины.

Таким образом, были получены и изучены иммунологические свойства препаратов четырех структурных белков вируса Марбург. На основе полученных экспериментальных данных может быть оценен возможный вклад каждого из изученных белков в формирование иммунного ответа против геморрагической лихорадки Марбург.

Разработка средств профилактики кори. Вакцина против кори в связи с принятием программы по элиминации этого заболевания, остро востребована. В настоящее время все производители выпускают живую вакцину для парентерального использования. Стратегия вакцинации, позволяющая индуцировать формирование барьерного иммунитета на слизистых оболочках, могла бы быть более эффективной при защите от кори.

Работа по изучению возможности получения эффективной пероральной формы вакцины проведена на двух видах животных  кроликах и обезьянах. У животных после иммунизации оценивали показатели гуморального и клеточного иммунитета. Иммунизированные обезьяны кроме этого были заражены диким штаммом вируса кори. На модели кроликов показали принципиальную возможность создания вакцины против кори для перорального применения, а на модели обезьян подтвердили, что вирус при внесении в просвет кишечника, может вызвать формирование гуморального и клеточного иммунного ответов (табл. 4).

Таблица 4

Изучение иммуногенных и протективных свойств живой коревой вакцины при пероральном применении в дозе 103,5 ТЦД50/животное

Модель

Иммунизация

Наличие вируса в крови

(количество животных, у которых обнаружен вирус кори в крови/общее количество животных)

Изучение иммуногенности

Изучение протек-тивности (количество животных, у которых появился вирус кори в крови/общее кол-во животных)

Гуморальный ответ

(количество животных с положительным ответом/общее количество животных)

Титр антител в ИФА

Клеточный ответ (кол-во животных с положительным ответом/общее количество животных)

Появление специфи-ческих CD3+CD8+ клеток

ИЛ-4

Кролик

перорально

1/6

4/6

1:16 – 1:32

н.и.*

н.и

н.и.

в/мышечно

1/4

2/4

1:32

н.и.

н.и

н.и.

Обезьяна

перорально

0/2

0/2

0/2

2/2

2/2

в просвет тонкого кишечника

0/2

1/2

(1:1250)

1/2

2/2

1/2

в/мышечно

1/2

2/2

(1:1250)

2/2

2/2

0/2

* - показатель не изучался.

При заражении иммунизированных обезьян диким штаммом BIL вируса кори обнаружено, что вирус в лаваже и мононуклеарных клетках крови определялся только у контрольной обезьяны и у трех обезьян, у которых согласно приведенным в таблице 3 данным не был сформирован иммунный ответ. Обе обезьяны, вакцинированные внутримышечно, и одна из обезьян, которым вирус был введен в просвет тонкого отдела кишечника, оказались защищены от заражения.

В другой серии экспериментов был сконструирован и проверен вариант кандидатной ДНК-вакцины против кори, представляющий собой рекомбинантную плазмиду, содержащую встройку гена гемагглютинина вируса кори и включенного в ВПЧ (рис. 4). Такого рода вакцина может быть востребована для иммунодефицитных пациентов, которым нельзя вводить аттенуированный вирус или для вакцинопрофилактики заболевания на поздних этапах выполнения программы элиминации кори.


  1   2   3   4

Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconПолучение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека 03. 01. 06. биотехнология

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconТеоретическое и практическое обоснование применения препаратов янтарной кислоты в системе мер профилактики вирусных инфекций телят 06. 02. 02. Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconКачанов владимир андреевич совершенствование специфической и химио- профилактики смешанных вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconИммунобиологические свойства хламидий, разработка и усовершенствование средств лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов сельскохозяйственных животных 03.

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconГематол и трансфузиол., 2005, т. 50, №3 © А. В. Терлецкий, Л. Г. Ахмерова, 2005
Отмече­но, что это кровепаразитарное заболевание сопровождается широким спектром патологических изменений в органах и тканях. Указано...

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconПримерная программа наименование дисциплины «Вирусология и биотехнология» Рекомендуется для направления подготовки (специальности) 111801 Ветеринария

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconРабочая программа дисциплины б3 в 2 использование методов биотехнологии в производстве бав направление ооп 240700 Биотехнология

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconОпорный конспект лекций по дисциплине «Биотехнология растений» для студентов специальности 050701 «Биотехнология» очной формы обучения

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconОстрое инфекционное заболевание дыхательных путей, вызываемое вирусом гриппа, входящее в группу острых респираторных вирусных инфекций

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций 03. 01. 06 биотехнология 03. 02. 02 вирусология iconЗадачи курса получение фундаментальных знаний в области методов прикладной бактериологии, вирусологии, серологической лабораторной диагностики. Согласно требованиям квалификационной характеристики

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU