Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа icon

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа





Скачать 151.6 Kb.
НазваниеУдк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа
Дата конвертации29.05.2013
Размер151.6 Kb.
ТипДокументы
УДК 619:616.9(06) 619:578.824.11


Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа

Е.С. Жилин, Ж.К. Кошеметов, В.М. Матвеева, А.Т. Татыбаева


E-mail: rabies8@mail.ru, zhumagali@srai.kz, matveeva-13@list.ru, ainura_84.08@mail.ru


РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» КН МОН РК, пгт. Гвардейский, Кордайский район, Жамбылская область, Республика Казахстан


Разработана тест-система и оптимизированы условия её постановки для выявления антигенов вируса бешенства на основе сэндвич метода твердофазного иммуноферментного анализа. Приведены результаты, свидетельствующие о достаточно высокой специфичности и чувствительности тест-системы, что позволяет предложить его для рутинной диагностики бешенства в качестве альтернативы импортным диагностикумам.

Ключевые слова: бешенство, вирус, антиген, иммуноглобулин, ТФ-ИФА, тест-система, сыворотка, конъюгат.


Введение


Восприимчивость к заболеванию всех видов домашних и диких животных, огромная опасность для человека определяют социальное и экономическое значение бешенства, и привлекает к нему пристальное внимание ветеринарной, медицинской науки и практики [1].

В большинстве регионов Казахстана эпизоотическая ситуация по бешенству чрезвычайно сложна - резко активизировались природные очаги этой инфекции, увеличилось число случаев заболеваний среди различных видов животных, ежегодно регистрируются случаи заболеваний людей с летальным исходом [2, 3]. Несмотря на проводимые мероприятия, в Республике Казахстан ограничить распространение рабической болезни и полностью ликвидировать бешенство животных до сих пор не удается.

Значимое место в борьбе с бешенством принадлежит экспресс диагностике, которая служит основанием необходимости проведения лечебно-профилактических и противоэпизоотических мероприятий. Для диагностики и выявления возбудителя бешенства разработаны и предлагаются различные методы: морфологическое исследование, реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП), метод иммунофлуоресценции, биологическая проба на лабораторных животных [4]. Среди тестов для ускоренной лабораторной диагностики бешенства животных интенсивно развивается метод иммуноферментного анализа. Явными преимуществами этого теста являются простота и быстрота выполнения, высокая чувствительность, стабильность реагентов, возможность количественного учета реакции, обработки большого количества проб, автоматизации процесса и объективность инструментального учета результатов [5]. Специфичность и чувствительность иммуноферментного теста для диагностики бешенства зависит от качества используемых иммунореагентов, оптимизации постановки теста и подтверждается способностью выявлять локальные предоминантные варианты вируса [6].

До настоящего времени использование данного теста в Республике Казахстан ограничено в связи с отсутствием коммерческих отечественных тест-систем для диагностики бешенства методом иммуноферментного анализа и высокой стоимостью импортных диагностикумов. Разработка и внедрение данного теста позволит проводить активный надзорза бешенством, результаты которого позволят адекватно оценить масштабы распространения данного заболевания на территории Республики Казахстан и своевременно принять научно-обоснованные противоэпизоотические и противоэпидемиологические мероприятия.

Целью настоящей работы являетсяразработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом ТФ-ИФА.


Материалы и методы


В качестве доноров антирабических антител были использованы козы и ослы. Для гипериммунизации использовали антиген, приготовленный из мозга животных, лабораторно зараженных вирусом бешенства штамм «Овечий» с использованием метода описанного Slonim О. etal [7]. Гипериммунизацию осуществляли с использованием схемы, описанной Luekrajang T. Etal [8] с соблюдением видоидентичности антигенов и вида продуцентов. Для выделения иммуноглобулинов использовали антирабические сыворотки с активностью в РДП не ниже 1:64. Иммуноглобулины выделяли спиртовым фракционированием по методу Кона [9], вирусоспецифические конъюгаты получали по модифицированному методу Wilson и Nakane[10], с использованием пероксидазы хрена фирмы «Sigma» (USA) тип VI-А.

Специфичность и активность антирабических сывороток и иммуноглобулинов оценивали в РДП с использованием антигенов из тест-системы для лабораторной диагностики бешенства в реакции диффузионной преципитации СТ ДГП 38934366-014-2009(НИИПББ, РК) и набора компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации (ВНИТИБП, РФ). Постановку реакции осуществляли по общепринятой методике.

Оптимальную сенсибилизирующую дозу иммуноглобулинов определяли в серии опытов «шахматного титрования» препаратов специфического и нормального антигенов против препаратов пероксидазных коньюгатов на планшетах, сенсибилизированных иммуноглобулином в разведениях с 1:100 до 1:600. Определяли средние величины (коэффициент позитивности) P/N, где Р и N - показатели оптической плотности положительной и отрицательной контрольной сывороток. Чем выше данный показатель, тем эффективнее идет процесс адсорбции. Оптимальные временные и температурные взаимодействия компонентов реакции: сенсибилизации лунок планшета специфическим иммуноглобулином, контакт антигена с иммуносорбентом и контакт антигена с коньюгатом проводили при 37°С, 30÷180 мин. Подбирали оптимальное рабочее разведение коньюгатов иммуноглобулинов (1:200÷1:1000), дающее максимальную цветовую реакцию при внесении их в планшеты с иммобилизированным на иммуносорбенте антигеном. Для выбора оптимальной твердой фазы испытывали полистироловые планшеты фирм «Costar» (USA), «Медполимер»(РФ), «Aptaca» (Италия), «Kohinoor» (Чехия), Nunc (Дания).

Учет результатов теста ТФ-ИФА проводили на фотометре марки «MultiskanPlus» при длине волны 405 нм (для АБТС) по отношению оптической плотности испытуемой сыворотки к оптической плотности нормальной сыворотки. Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемой сыворотки в 2 и более раза превышала оптическую плотность нормальной сыворотки и была не ниже 0,15.

Для проверки специфичности тест-системы ТФ-ИФА использовали культуральные и тканевые антигены вакцинных штаммов «Овечий», «МПТ-НИСХИ», «VRC-RZ2», «РВ-97», «ТС-80», локальных полевых изолятов«РАШТ», «РТ 001-07», «SVR-S1-2008», «SVR-B1-2007», «SVR-F1-2011», нормальные тканевые антигены (мыши, кролика, собаки, кошки, овцы, козы, КРС), нормальные культуральные антигены (ВНК-21, ПС, Vero), гетерогенные антигены (вируса болезни Ауески, чумы плотоядных, чумы мелких жвачных животных, катаральной лихорадке овец, листериоза).


Результаты и обсуждение


Историческая диагностика, основанная на обнаружении телец Бабеша-Негри в инфицированном мозгу, уступила свое место более чувствительным методам иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа. Несмотря на то, что до настоящего времени МФА является «золотым стандартом» в диагностике бешенства [6], данный метод имеет ряд недостатков, связанных с необходимостью использования для учета результатов люминесцентного микроскопа, подавления неспецифического свечения в патологически измененных тканях, возможностью исследования только проб свежего мозга, а также отсутствием количественной оценки теста [11].

Не уступая чувствительности и специфичности МФА, методы иммуноферментного анализа лишены выше перечисленных недостатков и к настоящему времени находят все большее применение в рутиной диагностики бешенства во многих странах мира [12]. Из всего многообразия известных на сегодняшний день различных вариантов ИФА, отличающихся по характеру используемых реагентов и последовательности отдельных этапов, для решения поставленной задачи нами был выбран двухцентровый метод ТФ ИФА. Высокая корреляция результатов сэндвич варианта ТФ-ИФА с результатами классической биопробы и МФА, а также возможность выявлять антиген вируса в пробах любой степени разложения и вне зависимости от использованных консервантов и фиксаторов делает этот тест идеальным, как в качестве самостоятельного метода диагностики, так и в сочетании с вышеописанными методами.

По данным разных авторов, порог данного теста варьирует в пределах 2-3lg МЛД50/мл [13]. Чувствительность метода может быть повышена использованием тестов на основе моноклинальных антител (МА), но для целей идентификации возбудителя болезни имеется необходимость использовать панели антинуклеокансидных и антигликопротеиновых МА на различные антигенные варианты вируса. Поэтому для диагностики бешенства наибольшее распространение получили наборы препаратов на основе поликлональных антител, поскольку данные антитела позволяют выявлять не только уникальные эпитопы, но и общие антигенные детерминанты антигенов вируса бешенства, тем самым повышая результативность реакции.

Важными критериями чувствительности, специфичности и воспроизводимости теста является активность, специфичность конъюгатов антител. А качество конъюгатов, в свою очередь, зависит от активности, специфичности и чистоты применяемых для конъюгации иммуноглобулинов или антител.

С этой целью нами была разработана схема получения гипериммунной антирабической сыворотки крови коз и ослов, которая позволила получить иммуноглобулины с титром преципитирующих антител - 1:64÷1:128. В результате электрофореза в ПААГ препаратов иммуноглобулинов выявлены профили, соответствующие легким и тяжелым цепям иммуноглобулинов G класса и слабовыраженные профили белков других классов, что свидетельствует о достаточной чистоте полученных препаратов. На основе выделенных иммуноглобулинов был приготовлен иммунопероксидазный конъюгат.

Поскольку чувствительность ИФА зависит от целого ряда физико-химических факторов (температура, ионная сила и рН реакционной среды, концентрационные соотношения компонентов и продолжительность их взаимодействия), при конструировании тест-систем на основе полученных препаратов использовали эмпирический подбор оптимальных параметров постановки теста.

Конструирование иммуноферментного диагностикума включало поиск оптимальных параметров тест-системы, от которых зависят чувствительность и специфичность проводимой реакции. Важным фактором в разработке тест-системы являлось определение условий адсорбции на твердой фазе, т.е. установление оптимальной концентрации иммуноглобулиновой фракции антирабических антител, состава сенсибилизирующего буфера, условий отмывания не связавшихся компонентов, времени и температуры связывания иммуноглобулинов с поверхностью лунок полистироловых планшетов, рабочей дозы приготовленного специфического конъюгата антител с пероксидазой.

Для подбора оптимальных условий сорбции оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при различных концентрациях иммуноглобулинов в растворе. Недостаток антител приводит к снижению чувствительности теста, а избыток к перерасходу дорогостоящего реагента. На достоверность результатов ИФА оказывает влияние неспецифическое связывание реагентов со свободными сайтами полистироловых планшет. В наших экспериментах мы испытывали различные количества антител в интервале 1÷20 мкг/мл (разведение иммуноглобулина 1:50 ÷ 1:600). Процесс адсорбции антител оценивали по интенсивности реакции с контрольными специфическими и негативными сыворотками. Наиболее оптимальный уровень насыщения поверхности планшет достигался при концентрации белка, равной 5 мкг/мл (1:200), при этом антитела с нормальными сыворотками реагировала отрицательно, а показатель позитивности составлял 4,5. При других испытанных концентрациях антител коэффициент позитивности варьировал от 3,0-4,2.

С целью снижения неспецифической реакции были проведены исследования по уменьшению фоновых «помех» при использовании различных концентраций бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буферном растворе для антигенов, конъюгата, и в качестве промывочного раствора. Были испытаны концентрации БСА 0,1, 0,5, 1, 2%. Исследования, проведенные в этом направлении, позволили установить, что блокирование свободных центров связывания на планшете целесообразно проводить 1% раствором БСА на фосфатно-солевом буфере рН 7,4 с добавлением 0,05% Твин-20, поскольку использование БСА в буфере уменьшало фоновые «помехи», на что указывали максимальные значения показателя позитивности, которые соответствовали для концентрации 0,1% - 3,8; 0,5% - 4,0; 1% - 4,6; 2% - 4,2, тогда как без использования БСА этот показатель равнялся 3,0. На основании этих данных в последующих исследованиях блокирование осуществляли 1%-ным раствором БСА в буферном растворе.

Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является рН комплексирующего буфера. Полистироловые планшеты сенсибилизировали антителами к антигенам вируса бешенства в буферных растворах с рН от 4,0 до 10,0: ацетатном, фосфатном и карбонат-бикарбонатном. На основании анализа результатов проведенных исследований было установлено, что при рН 9,6 0,1М карбонат-бикарбонатного буфера обеспечивался самый высокий уровень адсорбции поликлональных антител к антигенам вируса бешенства на поверхности полистироловых планшет.

Следующим этапом наших исследований стало изучение влияния температуры и времени экспозиции на адсорбцию антител к антигенам вируса бешенства в лунках планшета. Анализ результатов проведенных исследований позволил установить, что оптимальным для сенсибилизации лунок планшета иммуноглобулинами является режим при температуре 4°С в течение 24 ч. или в течение 18 ч. при температуре 20°С (коэффициент позитивности равен 4,5-5,0), в то время как при 37°С и выдержке в 1 ч. адсорбционная способность иммуноглобулинов несколько ниже (коэффициент позитивности около 4,4).

Для определения оптимального уровня активности полученных конъюгатов при проведении ИФА подбирали оптимальное рабочее разведение, дающее максимальную цветовую реакцию при внесении их в полистироловые планшеты. Было установлено, что при рабочем разведении 1:600 коэффициент позитивности составил 6,0 против 4,8-5,2 при разведениях 1:1000-1:800. При изменении концентрации в диапазоне 1:400-1:200 существенной разницы в значениях коэффициента позитивности отмечено не было. Данный факт свидетельствует о насыщении сорбционной емкости планшета конъюгатом, начиная с разведения 1:600.

Для определения оптимальной продолжительности инкубации антигена в твердофазном методе ИФА оценивали интенсивность реакции по коэффициенту позитивности в зависимости от времени инкубирования (15, 30, 60, 90 минут) при температуре 37°С.

Результаты проведенных нами исследований позволили установить, что 60-минутная экспозиция при температуре 37°С является оптимальным временем инкубации рабического антигена с адсорбированными иммуноглобулинами при постановке ИФА, поскольку установлено, что коэффициент позитивности в диапазоне от 15 до 60 мин возрастал с 5,4 до 6,4, а далее стабилизировался.

Оптимальнымиусловиями инкубирования пероксидазного конъюгата с антигеном на иммуносорбенте, являлись 40-60 мин, при 37°С. Увеличение коэффициента позитивности в данном случае происходило по мере увеличения срока инкубации. Однако разница в величине данного показателя при 40; 60; 90 и 120 мин. экспозицией оказалась незначительной.

При оптимизации условий постановки ТФ-ИФА также осуществлены испытания сорбционных свойств твердой фазы, в качестве которых использовались 96-луночные планшеты для ИФА. С этой целью проводили титрацию положительного антигена в планшетах различных производителей. В результате установлено, что максимальной способностью сорбировать рабический антиген и однородностью сорбции (вариации 4-5%) обладают планшеты фирмы Nunc (Maxisorb) и планшеты фирмы Costar. Другие испытанные планшеты обладали меньшей сорбционной способностью и однородностью сорбции (вариации 4-15%). В связи с этим для дальнейших экспериментов выбраны планшеты Nunc, Costar, позволяющие достигать более высокую чувствительность и стандартность анализа.

Изучение влияния растворов для разбавления специфических компонентов показало, что применение для разбавления антигенов ФБС (0,01М), NaCl (0,15М) или физиологического раствора показывает сравнительно равные результаты по чувствительности и специфичности метода ИФА.

С использованием полученных оптимальных параметров постановки теста были проведены испытания специфичности и чувствительности ТФ-ИФА. Результаты специфичности ТФ-ИФАпредставлены в таблице.


Таблица

Результаты специфичности тест-системы ТФ-ИФА

для выявления антигенов вируса бешенства


Исследуемые материалы

Количество проб

Титр антигенов

в ТФ-ИФА,

разведение

нормальные антигены:

Суспензии мозга клинически здоровых (мышей, собак, кошек, коз, овец, ослов, КРС)

43

0

антиген не зараженных клеток ПС, ВНК-21, Vero

16

0

специфические антигены вакцинных штаммов вируса бешенства:

Суспензии мозга мышей, инфицированных ВБ,

штамм (VRC-RZ02, CVS, Овечий, МПТ-НИСХИ, ТС-80)

42

1:160-1:2560

Суспензии мозга (крысы, кошки, собаки, корсака, козы) инфицированных ВБ, штамм «Овечий»

20

1:320-1:10240

антиген зараженных клеток ПС, ВНК-21 ВБ, штамм «VRC-RZ02»

23

1:160-1:5120

специфические антигены уличных вариантов вируса бешенства:

Изолят «РТ 001-07»

9

1:40-1:80

Изолят «РАШТ»

7

1:320-1:160

Изолят «SVR-C1-2007»

3

1:512

Изолят «Бустон»

5

1:512÷1:1024

Изолят «SVR-S1-2008»

12

1:1280-1:2560

Изолят «SVR-F1-2011»

14

1:1280-1:5120

Суспензии проб слюны животных инфицированных ВБ, изолятов «SVR-S1-2008», «SVR-F1-2011»

2

1:2560-1:5120

гетерологичные антигены:

Культуральные антигены вируса болезни Ауески, чумы мелких жвачных животных, оспы овец, катаральной лихорадки овец

24

0

Тканевые антигены вируса чумы плотоядных, вируса гепатита, мозговой антиген листериоза

12

0


Из таблицы видно, что при испытании разработанной тест-системы отсутствовали реакции с гетерологичными антигенами, при этом значения величин оптической плотности во всех случаях были ниже порога чувствительности и даже ниже значений оптической плотности в отрицательном контроле. В то же время тест-система позволяла выявлять антигены вируса бешенства вакцинных и уличных вариантов в культуральных и тканевых образцах материалов от различных видов животных. При этом отмечали отрицательную реакцию с нормальными антигенами. Полученные результаты были подтверждены испытанием аналогичной панели проб материалов с использованием коммерческого набора для лабораторной диагностики вируса бешенства методом иммуноферментного анализа, ВНИВИ, г Казань, Татарстан.

При испытании чувствительности тест-системы использовали десятикратные разведения заранее оттитрованного вируса бешенства штамма «VRC-RZ2», которые вносили в лунки планшет сенсибилизированных специфическими антителами к рабическим антигенам. Постановка реакции осуществлялась согласно вышеописанным отработанным параметрам. Чувствительность выявления рабического антигена для разработанного теста составила 2-2,5lg МЛД50/мл, что соответствовало данным, имеющимся в литературе [13].


Выводы


В результате проведенных исследований разработана тест-система выявления антигенов вируса бешенства на основе сэндвич метода твердофазного иммуноферментного анализа.

Установлены оптимальные параметры и условия постановки разработанного теста: сенсибилизация планшет фирм Nunc, Costar иммуноглобулинами в концентрации 5 мкг/мл (разведение 1:200), разбавленных в 0,1М карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,6, блокирование свободных сайтов связывания 1% раствором БСА в буферном растворе, время экспозиции антител с полистиролом планшета – 24 ч. при 4°С, 18 ч. при 20°С, 1 ч. при при 37°С, время экспозиции антигена с иммунособентом 60 мин при 37°С, рабочее разведение конъюгата 1:600, время инкубирования пероксидазного конъюгата с антигеном на иммуносорбенте 40-60 мин при 37°С.

В результате испытаний установлены высокая специфичность и чувствительность тест-системы к антигенам уличных и вакцинных вариантов вируса бешенства, что свидетельствует о пригодности её для диагностики бешенства и позволяет предложить данный тест для рутинной диагностики бешенства в качестве альтернативы импортным диагностикумам.


Литература


1. Хрипунов Е.М, Евсеева С.Д., Окрошидзе М.Г. и др. Бешенство диких плотоядных животных // Ветеринария. – 2002. - №2. – С. 6-8.

2. Абдрахманов С.К., Сытник И.И., Турсункулов Ш.Ж. Визуализация и анализ ветеринарно-географического распространения бешенства с использованием гис-технологий // Мат. V Международная науч.-практ. конф. (17-18 марта 2010 г.). - Барнаул: Изд-во АГАУ, 2010. - Кн. 3. - С. 283-286.

3. В Казахстане ухудшилась ситуация по бешенству (http://i-news.kz/news/2011/05/19/5532137 .html)

4. Недосеков В.В. Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики бешенства // Ветеринарная патология. – 2002. - №1. - С. 41-47.

5. Woldehiwet Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus // ClinChimActa. - 2005, 351(1-2):49-63.

6. OIE Terrestrial Manual 2011, Chapter 2.1.13. - Rabies (www.oie.int)

7. Slonim О., BrazdovaR., Slastny Р. Первичное стимулирование образования специфических нейтрализующих антител у баранов живым фиксированным вирусом бешенства в липоидном адъюванте // Вопросы ветеринарной вирусологии, 1970. - №. - С. 132-140.

8. Luekrajang T., Wansang J., Phanuphak P. Production of antirabie serum of equine origin // Laboratory techniques in rabies. - 4th ed. - Geneva: World Health Organization, 1996. - P. 9-27.

9. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals //OIE Web site at: http://www.oie.int/eng/OIE/organisation/en_LR.htm

10. Wilson, M. B., and P. K. Nakane. 1978. Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish Peroxidase (HRPO) to antibodies, p. 215. In W. Knapp, K. Holubar, and G.Wick (ed.), Immunofluorescent and related techniques. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam.

11. Янбарисова С.Р. Сравнение традиционных и экспресс-методов лабораторной диагностики бешенства // Ветеринарная медицина. – ГОД. - №. - С. 90-91.

12. Недосеков В.В. Разработка и совершенствование средств и методов диагностики бешенства животных и контроля эффективности антирабических вакцин / В.В. Недосеков, И.Ю. Хухоров // Тез. докл. матер. Междунар. научно-практ. конф. Ветеринарные и медицинские аснекты зооантронанозов. - Покров, 2003. - С. 47-49.

13. Meslin, F.-X.Laboratory techniques in rabies / F.-X.Meslin, M.M. Kaplan,

H. Koprowski // WHO 4-th ed. - Geneva, 1996. - P. 476.


Түйін


Тест-жүйе дайындалып, оны тұрақты фазалы иммундыферменттік талдаудың сэндвич әдісі негізінде құтырық вирусының антигендерін анықтауға қолдану шарттары оңтайландырылды. Берілген тест-жүйенің ерекшелігі мен жоғары сезімталдылығын дәлелдейтін нәтижелер берілді. Бұл нәтижелер тест-жүйенің шетел диагностикумдарына балама ретінде құтырық ауруын диагностикалауға ұсынуға мүмкіндік береді.


Summary


In the result of conducted researches was developed test-kit and conditions of its use for the detection of rabies virus antigens on the basis of sandwich method of solid phase enzymoimmunoassay were optimized. Presented results are evidence of a sufficiently high specificity and sensitivity of the test-kit and allow to offer it for routine diagnosis of rabies as an alternative to the import diagnosticums.

Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconУдк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства
Выделение вируса бешенства из патологических материалов проводили путем изоляции на кроликах. В ходе исследований были изучены патогенные...

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconУдк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconУдк 619: 616-07 Метод выделения ДНК и тест-система пцр в реальном времени для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconУдк 619: 616. 981. 55: 636. 2

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconУдк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconУчебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев, А. А. Щербаков, Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин удк 619: 616

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconРазработка и апробация тест-системы для выявления возбудителя цирковирусной инфекции свиней 2 типа методом пцр с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconУчебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев А. А. Щербаков Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин > И. Г. Швиденко удк 619: 616

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconРекомендации удк 619: 616. 9-085: 579. 852. 13Н эффективность препаратов при некробактериозе животных // Молочное и мясное скотоводство. 2006. №4. С. 39-41

Удк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа iconМетодическое пособие Издательство Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии 1999 удк 619: 67 (Х)

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU