Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией icon

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией





Скачать 344.17 Kb.
НазваниеФармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией
ИНДЮКОВ Андрей Леонидович
Дата конвертации25.05.2013
Размер344.17 Kb.
ТипАвтореферат
На правах рукописи


ИНДЮКОВ Андрей Леонидович


ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЦИДИСЕПТА-О ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ПОРОСЯТ И ТЕЛЯТ


16.00.04 – ветеринарная фармакология с токсикологией


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук


Воронеж – 2008


Работа выполнена в отделе фармакологии и токсикологии ГНУ Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии




Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Беляев Василий Иванович


Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Аргунов Муаед Нурдинович


кандидат ветеринарных наук, доцент

Кочетов Иван Алексеевич


Ведущая организация: Московская академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.


Защита состоится 19 февраля 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 006.004.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (ВНИВИПФиТ) по адресу: 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ


Автореферат разослан 25 декабря 2008 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета Ермакова Т.И.


1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Увеличение производства говядины и свинины непосредственно связано с сохранностью молодняка, особенно в условиях промышленной технологии ведения отрасли. Однако концентрация молодняка в крупных промышленных комплексах сопряжена с высокой заболеваемостью животных желудочно-кишечными болезнями бактериальной этиологии. При этом наибольший удельный вес среди желудочно-кишечных заболеваний поросят и телят приходится на долю колибактериоза, сальмонеллеза и дизентерии.

По данным департамента ветеринарии РФ основными заболеваниями сельскохозяйственных животных в 2007 году были желудочно-кишечные болезни, доля которых по всем заболеваниям у крупного рогатого скота составляла 35,6 %, у свиней – 48,3 %, а среди телят 52,4 %, поросят 53,2 % (Белковой И.И. и др., 2007).

При этом многочисленными исследованиями по изучению этиологии желудочно-кишечных болезней молодняка установлено, что в хозяйствах в возникновении этих заболеваний как правило, принимают участие ассоциации возбудителей, среди которых превалируют эшерихии и сальмонеллы (Шахов А.Г., 2008).

В связи с этим в борьбе с подобными заболеваниями в комплексе ветеринарных мероприятий необходимо использование новых антибактериальных средств, обладающих широким спектром антимикробного действия в отношении основных возбудителей – энтеробактерий.

Для подавления патогенной микрофлоры предложен широкий спектр препаратов, включающий в себя антибиотики, нитрофураны и сульфаниламиды. Однако длительное применение антибактериальных средств, в частности антибиотиков, приводит к появлению и широкому распространению резистентных штаммов микроорганизмов, к нарушению микробных экологических систем в пищеварительном тракте и возникновению дисбактериозов. В связи с этим особого внимания заслуживает разработка новых, не являющихся антибиотиками, препаратов для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных.

К таким препаратам в частности относится цидисепт-о на основе циминаля. По данным литературы (Машковский М.Д. и др. 1994г.) пара-нитро-α-хлоркоричный альдегид (циминаль) применяется в медицине в составе препаратов цимезоль и цидипол для лечения и профилактики гнойных осложнений при повреждении мягких тканей и для профилактики и лечения болезней мочеполовых путей вызванных трепонемами, гонококками, трихомонадами. Циминаль подавляет грамположительную и грамотрицательную микрофлору, способствует эпителизации и заживлению ран, оказывает прямое действие на цитоплазматическую мембрану микроорганизмов, адсорбируясь на ее фосфолипидных компонентах, что способствует нарушению ее проницаемости и выходу в среду водорастворимых компонентов цитоплазмы.

В ветеринарии препараты на основе циминаля используются для лечения ран (цидисепт-гель), при заболеваниях системы органов дыхания (цидисепт-аэро).

Исходя из указанных свойств циминаля разработан новый, не содержащий антибиотиков, антибактериальный препарат цидисепт-о. Однако данных по токсикометрическим параметрам, фармакологическим свойствам и эффективности цидисепта-о при колибактериозе в литературе нет.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось исследование фармако-токсикологических свойств препарата на основе пара-нитро-α-хлоркоричного альдегида – цидисепта-о и эффективности его при профилактики и лечении колибактериоза поросят и телят.

Для достижения указанной цели на разрешение были поставлены задачи:

- определить фармако-токсикологические свойства цидисепта-о (параметры и класс токсичности, хроническую токсичность препарата, раздражающие, аллергенные, эмбриотоксические и тератогенные свойства, распределение в органах и тканях, сроки выведения остаточных количеств цидисепта-о из организма поросят);

- изучить влияние препарата в различных дозах на клинико-биохимические показатели лабораторных животных, поросят и телят;

- оценить структурное состояние органов и тканей животных при применении цидисепта-о в различных дозах;

- определить профилактическую и лечебную эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят.

1.3. Научная новизна работы. Впервые дана токсикометрическая характеристика нового, неантибиотического, антибактериального препарата цидисепт-о, изучены его фармакологические параметры и свойства, влияние на клинико-биохимические показатели животных. Установлены пути и сроки выведения препарата из организма животных, доказана его лечебная и профилактическая эффективность при колибактериозе телят и поросят, дана экономическая оценка применения цидисепта-о в ветеринарии.

1.4. Практическая значимость работы. В практику ветеринарной медицины предложен новый антибактериальный препарат цидисепт-о для профилактики и лечения колибактериоза поросят и телят, кроме того дана фармако-токсикологическая оценка цидисепта-о, показано влияние его на гомеостаз лабораторных и сельскохозяйственных животных. Результаты исследований включены в нормативно – техническую документацию на цидисепт-о.

1.5. Апробация работы. Результаты экспериментов автора были представлены на первом съезде ветеринарных фармакологов (Воронеж 2007), научно-практической конференции фармакологов РФ посвященной 85-летию М.И. Рабиновича (Троицк, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней животных и птиц» (Екатеринбург, 2008), Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел (Москва, 2008), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка» (Воронеж 2008).

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них три в журналах рекомендованных ВАК РФ. В публикациях отражено основное содержание диссертации.

1.7. Основные положения, выносимые на защиту:

- токсикологические и фармакологические свойства цидисепта-о;

- биохимические, гематологические и гистоморфологические показатели животных при применении цидисепта-о в различных дозах;

- лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, иллюстрирована 54 таблицами, 11 рисунками и 2 графиками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы состоит из 160 источников, из которых 52 иностранных.


2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2005-2008 гг. во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте патологии фармакологии и терапии в соответствии с планом НИР ВНИВИПФиТ по заданию 08.04.01 (№ гос. регистрации 01.2000.11.17018). Научно-производственные исследования проведены на базе хозяйств Воронежской области (ОАО «Юбилейный» Хохольского района и ООО «Вероника» Калачеевского района).

Отдельные исследования по определению параметров токсичности изучаемого препарата и по его влиянию на животных проведены при участии сотрудников ВНИВИПФиТ: доктора биологических наук Востроиловой Г.А., профессора Сулейманова С.М., кандидата ветеринарных наук Михайлова Е.В., кандидата биологических наук Шушлебина В.И. Определение антимикробной активности цидисепта-о проводилось под руководством член-корреспондента РАСХН Шахова А.Г. В проведении научно-хозяйственных экспериментов принимали участие кандидат биологических наук Алехин Ю.Н., научный сотрудник Куркин Е.В. и другие. Указанным лицам автор выражает искреннюю признательность и благодарность за оказанную помощь.

Для решения поставленных задач были организованы и проведены лабораторные и научно-производственные опыты на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Объектами наших исследований являлись беспородные белые мыши и крысы, морские свинки породы «Альбинос», кролики породы «Белый великан», поросята крупной белой породы, телята симментальской породы, а так же кровь, плазма, сыворотка крови, гистологические препараты.

Для оценки антимикробной активности, фармако-токсикологических свойств и лечебно-профилактической эффективности цидисепта-о провели ряд опытов и исследований, схема и объем которых приведены в таблице 1.

Таблица 1

Схема и объем экспериментальных и научных исследований

Задачи исследования

Вид животных

Количество животных

Показатели

1

2

3

4

Антимикробная активность

Культуры микроорганизмов

E.coli 078

E.coli 08

E.coli 0142 (п)

E.coli A 20

500000 клеток в 1 мл среды

Минимальная подавляющая концентрация.

Острая токсичность

Белые мыши

Белые крысы

60

60

Определение ЛД50 при введении per os.

Хроническая токсичность

Белые крысы

60

Динамика массы тела, коэффициенты массы внутренних органов, морфологические, биохимические показатели крови, гистоморфологич. показатели, клиника.

Субхроническая токсичность

Поросята

12

Клиническое состояние, прирост массы тела, морфологические, биохимические показатели.

Раздражающее действие

Кролики

12

Клиническое состояние (поведение, рефлексы, температура тела, пульс, дыхание). Влияние на конъюнктиву глаз, на кожу (гиперемия, отек, эритема).

Аллергизирующие свойства

Морские свинки

Белые крысы

11

8

Сенсибилизация, показатель РДТК.

Эмбриотоксическое и тератогенное действие

Белые крысы

30

Количество желтых тел, мест имплантации, эмбрионов (живых и мертвых), средний вес крысенка, его длина, масса плаценты, аномалии развития.

Фармакокинетика препарата

Поросята

Телята

22

8

Содержание цидисепта-о в крови, печени, почках, мышцах, моче.

Лечебно-профилактическая эффективность

Поросята

Телята

102

107

Клиническое состояние, биохимические показатели крови, данные бактериологии.

Формирование групп экспериментальных животных и организация их нормированного кормления, учет их роста, взятие проб крови осуществлялось на основании действующих государственных стандартов, а также методических положений и установок, разработанных ВИЖ и РАСХН.

Антимикробную активность цидисепта-о изучали методом серийных разведений в отношении референтных и полевых штаммов микроорганизмов, основных возбудителей желудочно-кишечных болезней у поросят и телят типированных по морфологическим, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам. Минимальную подавляющую кон­центрацию (МПК) цидисепта-о определяли методом разведений в мясопептонном бульоне (МПБ).

Острую токсичность цидисепта-о изучали в опытах на белых мышах и белых крысах при внутрижелудочном введении препарата. Среднюю дозу эффекта определяли аналитическим способом Спирмена-Кербера (Лакин Г.Ф., 1990).

Хроническую токсичность цидисепта-о изучали на белых крысах в опыте при длительном скармливании препарата в течение 21 дня в дозах ориентировочно терапевтической и в 3 и 5 раза выше терапевтической.

Изучение субхронической токсичности цидисепта-о проводили на поросятах при пероральном введении препарата в течение 14 дней в терапевтической дозе (0,5 мл/кг). Общетоксическое действие препарата оценивали по клиническому состоянию животных, по динамике массы тела поросят, гематологическим и биохимическим показателям крови и мочи.

Изучение раздражающего действия цидисепта-о проводили на белых кроликах и морских свинках методом накожных аппликаций при одно - и многократном нанесении и втирании чистого (нативного) препарата, а также путем постановки конъюнктивальной пробы.

Исследование специфических видов токсичности препарата определяли путем изучения аллергизирующих свойств, эмбриотоксичности и тератогенности цидисепта-о.

Аллергенность цидисепта-о изучали путем постановки кожных реакций, конъюнктивальной пробы у сенсибилизированных препаратом морских свинок, а также путем постановки реакции дегрануляции тучных клеток (РДТК), используя белых крыс в соответствии с Методическими рекомендациями, разработанными в НИИ медицины труда АМН РФ по единой схеме постановке токсикоаллергических экспериментов.

Эмбриотоксическое и тератогенное действие цидисепта-о изучали по методике Шицковой А.П. (1977). Раннюю и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность определяли по формулам, предложенным Малашенко A.M., Егоровым И.К. (1977).

Для оценки общего действия цидисепта-о на организм лабораторных животных, поросят и телят, лечебной и профилактической эффективности препарата при колибактериозе проводили оценку клинического состояния животных, морфологических и биохимических показателей крови.

В крови определяли: количество лейкоцитов, гемоглобина, СОЭ. Фракции белка определяли электрофорезом в агарозном геле, концентрацию общего белка, липидов и билирубина наборами фирмы «Vital Diagnostics», концентрацию мочевины, фосфора, холестерина, глюкозы, креатинина, кальция, активность аспартат- и аланинаминотрасфераз (АсАТ и АлАТ), щелочной фосфатазы и γ-глутамилтрансферазы - на биохимическом анализаторе «Hitachi-902». Определение содержания средних молекул, сорбционную способность эритроцитов проводили по Ю.Н. Алехину и др. (2000-2007).

Исследование мочи (удельный вес, pH, нитриты, белок, глюкоза, кетоны, уробилиноген, билирубин, кровь) проводили, используя специальные тест - полоски (DEKA PHAN ASCO).

Определение остаточного содержания цидисепта-о в органах, тканях и биологических жидкостях проводили спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 313 нм.

Диагноз на заболевание поросят и телят желудочно-кишечным заболеванием бактериальной этиологии (колибактериоз) устанавливали на основании анализа данных эпизоотологической ситуации в хозяйстве, клинического состояния животных, данных патологоанатомического вскрытия и лабораторных бактериологических исследований.

Экономическую эффективность цидисепта-о при профилактики и лечении колибактериоза поросят и телят рассчитывали в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий, утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ РФ (1997 г.).

Опыты проведены в соответствии с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по постановке контроля, подбору аналогов, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных в пе­риод исследования (И.Т. Фролов, 1965).

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием прикладной программы «Statistica 5.0» на PC «Pentium III». Достоверность отличий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента (Г.Ф. Лакин, 1990).


3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Антимикробная активность цидисепта-о.

Изучение антимикробной активности цидисепта-о в опытах in vitro показало, что препарат обладает высокой активностью в отношении большинства тестируемых музейных (референтных) и полевых (эпизоотических) культур микроорганизмов. Минимальная подавляющая рост концентрация цидисепта-о в отношении культур E.coli 08, E.coli A 20 составила 7,8 мкг/мл, в отношении культур E.coli 0142 (п), E.coli 078 – 15,6 мкг/мл.

3.2. Острая токсичность цидисепта-о.

Определение параметров токсичности цидисепта-о в остром опыте, при однократном пероральном введении, выполнили на двух видах лабораторных животных: белых крысах и белых мышах. При токсикометрической оценке цидисепта-о испытывали следующие дозы: 5,0; 10,0; 15,0; 20,0; 25,0 и 30,0 мл/кг. Среднелетальную дозу - LD50 препарата определить не удалось, так как при введении внутрь цидисепта-о в максимально возможных объемах (0,6 мл - белым мышам и 6,0 мл - белым крысам) в дозе 30,0 мл/кг массы тела не отмечалось гибели животных. Исходя из полученных данных считаем, что препарат по степени токсичности относится к IV классу опасности - малоопасные вещества (ГОСТ 12.1.007-76).

3.3. Хроническая токсичность цидисепта-о.

Изучение хронической токсичности цидисепта-о проводили на белых крысах при многократном введении препарата 21 день подряд с кормом в терапевтической (0,5 мл/кг), трёх- (1,5 мл/кг) и пятикратной терапевтической (2,5 мл/кг) дозах. На протяжении всего опыта гибели крыс в контрольной и опытной группах зарегистрировано не было. Препарат не вызывал изменений в реакции на внешние раздражители, а также нарушений в двигательной активности крыс. Животные, получавшие препарат лучше поедали корма, отличаясь более хорошим аппетитом. Цидисепт-о способствовал приросту массы тела белых крыс, величина которого зависела от дозы препарата. При введении крысам цидисепта-о с кормом в дозах 0,5 и 1,5 мл/кг массы тела наблюдался ростостимулирующий эффект. Однако при дозировке 2,5 мл/кг происходило снижение привесов массы тела у крыс как на 7-й, так и на 14 и 21-й день применения препарата (рис. 1).

Рис. 1. Динамика привесов крыс, получавших цидисепт-о в дозе 0,5; 1,5 и 2,5 мл/кг массы тела и контрольной группы

Коэффициенты массы внутренних органов крыс, получавших препарат в течение 21 дня в дозах 0,5;1,5 и 2,5 мл/кг массы тела существенно не отличались от контроля.

При исследовании крови крыс, получавших цидисепт-о в терапевтической (0,5 мл/кг) и трехкратной терапевтической (1,5 мл/кг) дозах, не отмечено по сравнению с контролем достоверных изменений биохимических показателей на 7,14 и 21-й день применения препарата. Среднее значение исследованных показателей у опытных животных не выходило за границы физиологической нормы для данного вида животных. При увеличении дозы цидисепта-о до 2,5 мл/кг и лишь на 21-й день применения препарата отмечалось более напряженное функционирование выделительной системы и печени (табл.1).

Таблица 1

Морфологические и биохимические показатели крови белых крыс при многократном пероральном введении цидисепта-о на 21-й день применения препарата

Показатели

1 гр.

(контроль)

2 гр. (0,5 мл/кг)

3 гр. (1,5 мл/кг)

4 гр. (2,5 мл/кг)

СОЭ, мм/ч

1,5±0,3

1,3±0,3

1,5±0,2

1,4±0,0

Лейкоциты,109

11,6±1,1

11,8±0,6

10,9±0,7

11,5±0,8

Гемоглобин, г/л

120,2±8,5

121,4±2,1

127,6±5,9

123,9±7,7

Фосфор, мМ/л

2,15±0,1

2,2±0,1

2,2±0,2

2,1±0,2

Общий белок, г/л

68,5±4,2

69,3±1,3

77,2±2,8

80,1±1,9*

Альбумины, %

41,6±1,6

40,6±1,3

34,8±3,6

30,1±1,1*

α - глобулины, %

17,1±1,6

17,2±1,1

15,3±1,1

14,0±1,6

β –глобулины, %

10,5±0,9

10,7±0,9

12,5±0,9

13,3±1,3*

γ - глобулины, %

30,8±2,7

31,5±2,1

37,4±3,7

42,6±3,1*

Мочевина, мМ/л

5,1±0,1

5,2±0,2

5,5±0,6

5,8±0,3*

Креатинин, мкМ/л

78,0±5,2

83,5±5,3

93,1±7,1

98,6±5,1*

Глюкоза, мМ/л

8,3±1,0

9,3±1,8

8,9±0,6

7,6±0,1

Холестерин, мМ/л

2,7±0,3

2,8±0,1

3,1±0,3

3,6±0,5

АсАТ, мМ/л.час

1,6±0,1

1,7±0,7

1,8±0,1

2,1±0,3*

АлАТ, мМ/л.час

1,3±0,1

1,2±0,4

1,4±0,1

1,5±0,1

ЩФ, мМ/л.час

5,6±0,1

5,2±0,3

5,1±0,6

8,5±1,1*

* - Р < 0,05 по сравнению с контролем

Наблюдалось повышение по сравнению с контролем содержания в сыворотке крови мочевины в среднем на 12,7 %, креатинина – на 26,4 %. У крыс данной группы произошло увеличение уровня общего белка на 16,9 %, β-глобулинов на 26,7 % и γ-глобулинов на 38,3 %, а концентрация альбуминов снижалась на 27,6 %, α-глобулинов на 18,1 %.

Активность щелочной фосфотазы повысилась по отношению к контрольной группе крыс на 51,6 %, АсАТ и АлАТ – на 31,1 и 12,9 %.


3.4. Гистологические изменения в органах и тканях экспериментальных животных при хроническом применении цидисепта-о.

При изучении структурной организации паренхиматозных органов у белых крыс, получавших цидисепт-о в течение 21 дня ежедневно в дозах 0,5; 1,5 и 2,5 мл/кг было выяснено, что препарат в дозах 0,5 и 1,5 мл/кг не влияет негативно на структурную организацию печени, почек, легких, сердца, селезенки, слизистой оболочки желудка, семенников, надпочечников и тимуса белых крыс как на 7-й день, так и на 14 и 21-й дни исследования.

Наблюдаемые, при дозе препарата в 5 раз превышающую терапевтическую (2,5 мл/кг) и лишь на 21 день применения цидисепта-о, дистрофические процессы в печени, почках и слизистой оболочке желудка носили обратимый характер (рис. 2,3,4).





Рис. 2. Десквамация эпителия слизистой оболочки желудка на 21-й день при дозе цидисепта-о 2,5 мл/кг





Рис. 3. Дистрофические процессы в почечных канальцах на 21-й день при дозе цидисепта-о 2,5 мл/кг





Рис. 4. Дистрофические процессы в паренхиме печени на 21-й день при дозе цидисепта-о 2,5 мл/кг


3.5. Раздражающее действие цидисепта-о.

Изучение раздражающего действия цидисепта-о проведено на кроликах и морских свинках в соответствии с общепринятыми в токсикологии методами. При нанесении нативного препарата на конъюнктиву глаза кроликам не было отмечено гиперемии, слезотечения, выделений и отека век. Клиническое состояние организма кроликов оставалось в пределах нормы, т.е. не выяв­лялись изменения в температуре тела, частоте пульса и количестве дыхатель­ных движений.

При однократном нанесении цидисепта-о на кожные покровы, препарат не вызывал раздражающего действия.

Накожные аппликации цидисепта-о в течение 20 дней подряд в объеме 0,1 мл на 4 см2 кожного покрова, не вызывали раздражающего действия - повреждений кожи в виде эритемы или ее отеков.


3.6. Аллергизирующие свойства цидисепта-о.

Изучение аллергенных свойств препарата включало в себя несколько методов аллергодиагностики in vivo и in vitro.

При исследовании аллергизирующего действия цидисепта-о на морских свинках после перорального введения препарата ежедневно в течение 30 дней с последующими кожными тестами на 10, 15 и 30 дни от начала введения цидисепта-о, гиперчувствительности к препарату не возникало. Гиперемии, отека и десквамации кожи также отмечено не было.

При постановке конъюнктивальной пробы морским свинкам, предварительно сенсибилизированных цидисептом-о, не было отмечено гиперчуствительности животных к препарату, как через 15 мин (быстрая реакция), так и через 24-48 часов (гиперчувствительность замедленного типа) после нанесения препарата на конъюнктиву глаз.

При постановке РДТК не выявлено аллергической реакции сенсибилизированных животных на исследуемый препарат. РДТК – отрицательная.


3.7. Эмбриотоксическое и тератогенное действие цидисепта-о.

Эмбриотоксическое и тератогенное действие цидисепта-о изучали на самках белых крыс. Животным второй и третьей группы на пятый день беременности (период имплантации) перорально задавали цидисепт-о в дозе 0,5 и 2,5 мл/кг массы тела соответственно. Животным четвертой и пятой группы препарат задавали на 10 день беременности (период органогенеза) в дозе 0,5 и 2,5 мл/кг массы тела, первая группа – контрольная.

Для выявления повреждающего действия препарата на плод часть самок убивали на 20 день беременности. Другую половину самок оставляли до наступления естественных родов. Наблюдения за полученным молодняком осуществляли в течение 30 дней.


Таблица 2

Эмбриотоксическое и тератогенное действие цидисепта-о

Группа


Показатели


1


2


3



4



5


Количество живых эмбрионов на одну самку

9,3±0,3

9,7±0,3

9,7±1,2

10,3±0,3

9,3±0,7

Количество мертвых эмбрионов на одну самку

0,7±0,3

0,3±0,3

0,7±0,3

0,3±0,3

0,7±0,3

Количество мест имплантации на одну самку

10,0±0,3

10,0±0,3

10,3±1,5

10,7±0,3

10,0±1,0

Количество желтых тел на одну самку

10,7±0,3

10,7±0,3

10,7±1,2

11,3±0,3

10,7±1,3

Доимплантацион. гибель, %

6,1±3,1

6,3±3,2

3,7±3,7

5,8±2,9

5,5±2,7

Постимплантацион. гибель, %

6,3±3,2

3,0±3,0

5,9±3,0

3,0±3,0

6,0±3,0

Общая эмбриональная смертность, %

12,2±2,2

9,3±0,3

9,6±1,0

8,8±0,2

11,1±5,6

Выживаемость,%

90,9±9,1

92,8±3,7

92,5±4,8

93,6±3,2

90,6±5,6

Средний вес крысенка, мг

3651,2±

280,7

3749,3±

230,7

4075,3±

276,3

3741,0±

209,0

3825,6±

111,0

Средняя длина туловища крысенка, см

3,4± 0,1

4,3±0,9

3,8±0,2

3,5±0,1

4,4±0,5

Уродства, аномалии развития


нет


нет


нет


нет


нет

В опыте по определению эмбриотоксических свойств цидисепта-о на самках белых крыс установлено, что цидисепт-о при пероральном введении его крысам опытных групп на 5-й (период имплантации) и 10-й день беременности (период эмбриогенеза) в дозе 0,5 и 2,5 мл/кг не оказывает токсического действия на развивающиеся зародыши. Напротив его применение оказывает положительное влияние на эмбриогенез и постнатальное развитие крысят. Установлено, что количество живых эмбрионов во 2-й (0,5 мл/кг на 5-й день беременности) и 3-й (2,5 мл/кг на 5-й день) группах было больше на 3,6 % чем в контроле, в 4-й группе (0,5 мл/кг на 10-й день) этот показатель превышал данные контрольной группы на 10,7 %. Доимплантационная гибель у крыс 3, 4 и 5-й опытных групп была ниже, чем в контроле на 39,8 %, 5,4 %, 9,3 % соответственно. Постимплантационная гибель у крыс 2,3,4 и 5-й опытных групп также была ниже по отношению к контролю на 52,6 %, 6,8 %, 52,6 %, 5,2%. Общая эмбриональная смертность у животных опытных групп также была ниже, чем в контроле на 23,7 %, 21,5 %, 28,3 %, и 9 %. Выживаемость крыс 2, 3 и 4-й опытных групп была выше, чем в контроле на 2,1%, 1,8%, 3%.

Тератогенного действия цидисепта-о не установлено. Вес крысят, масса всего помета, кранио-каудальный размер крысят при рождении у животных опытных групп был выше, чем у потомства контрольной группы. Такая же тенденция прослеживалась на 10, 20 и 30 день после рождения при контрольных взвешиваниях и замерах. По другим показателям общего развития у крысят контрольных и подопытных групп не наблюдалось различий. Уши открывались на 2-3 день жизни, с 8 дня крысята начинали обрастать шерстью, между 16 и 19 днем у них открывались глаза.


3.8. Изучение субхронической токсичности цидисепта-о на поросятах.

Определение субхронической токсичности цидисепта-о проводили на поросятах. Первая группа животных была контролем, поросятам второй группы перорально задавали препарат в дозе 0,5 мл/кг массы тела в течение 14 дней.

Установлено, что многократное пероральное введение цидисепта-о в дозе 0,5 мл/кг массы тела не вызывает существенных изменений в клиническом состоянии поросят. На протяжении опыта животные опытной и контрольной группы, были энергичными, подвиж­ными, без проявления каких-либо клинических признаков заболевания, имели хороший аппетит, рефлексы сохранены. Нарушений функции пищеварения и мочеотделения не установлено.

При проведении опыта была отмечена тенденция увеличения среднесуточных привесов у поросят, получавших препарат, по отношению к контрольной группе. В частности на 7-й день применения препарата вес поросят опытной группы был на 6,3 % выше веса поросят контрольной группы, на 14-й день разница составила 5,3%.

Достоверных изменений морфологических показателей крови поросят, получавших препарат, не имелось, а незначительные колебания показателей находились в пределах физиологической нормы.

Тоже самое, можно отметить, при анализе биохимических данных крови и мочи поросят, получавших цидисепт-о. Показатели, характеризующие функциональное состояние печени, почек, других органов и систем, белковый, углеводный, липидный, минеральный обмен и активность ферментных систем находились в пределах колебаний физиологической нормы.


3.9. Определение содержания циминаля в органах, тканях и биологических жидкостях животных.

3.9.1. Определение содержания циминаля в крови поросят и телят при однократном его применении.

Для изучения фармакокинетики цидисепта-о в первый опыт было подобрано 8 поросят массой тела 9-10 кг. Во второй опыт - 8 телят массой тела в среднем 40 кг. Поросятам и телятам вводили цидисепт-о индивидуально однократно с питьем в дозе 0,5 мл/кг.

Рис.5. Содержание циминаля в крови поросят и телят после введения цидисепта-о в дозе 0,5 мл/кг массы тела.

Через 1, 3, 6, 9, 12 и 24 часа после введения препарата брали кровь для исследования у поросят из хвостовых сосудов, у телят из яремной вены и определяли содержание циминаля.

Установлено, что цидисепт-о быстро всасывается после перорального введения. Через 3 часа после введения препарата содержание циминаля в крови поросят и телят составило 6,05 и 9,99 мкг/мл соответственно. Терапевтическая концентрация циминаля в крови сохранялась до 24 часов.

3.9.2. Определение остаточного содержания циминаля в органах, тканях и биологических жидкостях свиней при длительном его применении.

Определение остаточных количеств циминаля было проведено на 14 клинически здоровых поросятах 2-х месячного возраста, из которых два были контрольными, им препарат не применялся. Поросятам опытной группы в течение 5-ти дней один раз в сутки вводили цидисепт-о в дозе 0,5 мл/кг массы тела.

Для проведения исследований убивали по 3 опытных животных через 1, 3, 5 и 7 суток после последнего введения цидисепта-о. По одному контрольному животному исследовали через 3 и 7 суток. Содержание циминаля определяли в крови, моче, печени, почках, бедренной мышце.


Рис.6. Содержание циминаля в органах и биологических жидкостях поросят после 5-ти дневного орального применения цидисепта-о в дозе 0,5 мл/кг

Установлено, что через 1 сутки после последнего введения цидисепта-о препарат определяется во всех исследуемых органах и биологических жидкостях. Наибольшее его количество содержится в печени, почках.

Через 3 суток после последнего введения цидисепта-о остаточные количества препарата также определялись во всех исследуемых материалах. Наибольшая его концентрация содержалась в моче, она повысилась по отношению к первому дню после последнего введения препарата на 47,5 % и составила 4,63±0,17 мкг/мл. Это говорит о том, что препарат на третьи сутки после последнего применения активно начинает выводиться из организма с мочой.

На 5-е сутки после последнего введения препарата циминаль в крови и мышцах не обнаруживался, содержание его в моче составляло 0,06±0,00 мкг/мл, а в печени и почках - 0,01±0,00 мкг/мл.

На 7 сутки после последнего введения препарата циминаль отсутствовал во всех исследуемых органах, тканях и биологических жидкостях организма поросят.


3.10. Профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят.

Профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят была изучена в двух опытах.

В первом опыте было изучено профилактическое действия препарата при колибактериозе поросят полученных от свиноматок, которым задавали цидисепт-о во время супоросности. Для опыта было подобрано 10 супоросных свиноматок, аналогов по возрасту, массе тела, количеству опоросов. Свиноматкам опытной группы (n-5) за 8-10 дней до опороса с кормом 5 дней подряд задавали цидисепт-о в дозе 0,5 мл/кг массы тела, животным контрольной группы (n-5) с кормом препарат не вводили. За поросятами, полученными от свиноматок контрольной и опытной групп осуществляли наблюдение в течение 14 дней, учитывая заболеваемость и падеж.

У 8 поросят (16,3%), полученных от свиноматок группы контроля, на 7 день после опороса были обнаружены признаки заболевания. У поросят, полученных от свиноматок опытной группы за период наблюдения (14 дней) случаев возникновения заболевания зафиксировано не было.

На поросятах в возрасте 14 дней провели второй опыт по оценке профилактической эффективности цидисепта-о при пероральном введении цидисепта-о.

Поросятам опытной группы (n-51) задавали цидисепт-о 1 раз в день 5 дней подряд в дозе 0,5 мл/кг массы тела. Поросятам группы контроля (n-41) препарат не вводили. Для оценки действия препарата за животными вели ежедневное наблюдение в течение 30 дней, учитывали их заболеваемость и падеж.

В группе контроля из 41 животного колибактериозом переболело 15 поросят (36,6 %). В группе животных, получавших цидисепт-о, из 51 поросенка заболевание зарегистрировано у 5 (9,8 %). Профилактическая эффективность цидисепта-о в опытной группе при колибактериозе поросят составила 90,2 %, а заболеваемость в контрольной - 36,2 %.


3.11. Лечебная эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят.

С целью оценки лечебной эффективности цидисепта-о при колибактериозе поросят было проведено два опыта на поросятах разного возраста.

Первый опыт был проведен на 8 поросят 6-7 дневного возраста, больных колибактериозом. Для лечения данных животных использовали цидисепт-о в дозе 0,5 мл/кг массы тела в течение 7 дней (5 дней составил курс лечения и 2 дня – в целях профилактики рецидива) перорально индивидуально каждому больному. Терапевтическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят 6-7 дневного возраста составила 87,5 %, летальность - 12,5 %, средняя продолжительность болезни - 4,1±0,71.

Во втором опыте лечебную эффективность цидисепта-о оценивали на 26-29 дневных поросятах больных колибактериозом. Лечебные свойства цидисепта-о изучали в сравнении с дизпарколом. Больных поросят разделили на две группы по 10 голов в каждой.

Поросятам опытной группы индивидуально каждому животному перорально задавали цидисепт-о в дозе 0,5 мл/кг массы тела. В контрольной группе внутримышечно вводили дизпаркол в дозе 0,2 мл/кг массы тела 1 раз в сутки. Препараты применяли до исчезновения клинических признаков заболевания и в течение 2 дней после. Терапевтическая эффективность цидисепта-о составила 80 %, тогда как дизпаркола - 70 %.


3.12. Лечебная эффективность цидисепта-о при колибактериозе телят.

Для изучения возможности использования цидисепта-о в комплексном лечении колибактериоза телят, были проведены два опыта. В первом опыте изучали эффективность препарата при лечении телят 2-7 дневного возраста.

Больным животным в группе контроля в качестве антимикробного средства назначали препарат «Антидиарейко» (Invesa). В опытной группе применяли цидисепт-о, который задавали внутрь два раза в день за 15-20 минут до кормления в дозе 0,5 мл/кг. Антимикробные препараты назначали до исчезновения диареи и ещё один день для профилактики рецидивов. Терапевтическая эффективность цидисепта-о составила 70 %, что выше чем в сопоставимом варианте на 10,4 % и на 4,4% ниже летальность, чем в контроле при лечении «Антидиарейко».

Во втором опыте терапевтическая эффективность цидисепта-о изучалась на телятах в возрасте 1-2 месяцев при желудочно-кишечных заболеваниях бактериальной этиологии, протекающих с синдромом гастроэнтерита. У данных животных имела место ассоциативная кишечная инфекция с доминирующей ролью Е. coli (сероварианты 0117, 0119, 0149 и А20) и Enterococcus faecalis.

Больным животным в группе контроля назначали фуразолидон, который задавали внутрь два раза в день в дозе 5 мг/кг. В опытной группе применяли цидисепт-о в дозе 0,5 мл/кг, внутрь два раза в день за 15-20 минут до кормления. Антимикробные препараты назначали до исчезновения диареи и ещё один день для профилактики рецидивов.

Цидисепт-о оказал выраженный терапевтический эффект и составил 89,3%. При его применении не выявлено осложнений или побочных эффектов. В опытной группе, в сравнении с контрольной где назначали фуразолидон, был выше терапевтический эффект на 16,8%, а летальность ниже на 2,14%. Среди животных которым применяли цидисепт-о повторное заболевание наблюдалось на 9,2% меньше, а среднесуточный привес был на 24,7% больше чем после проведения базовой схемы лечения.


4. ВЫВОДЫ.

1. Цидисепт-о – неантибиотический, антибактериальный препарат на основе хлоркоричного альдегида (циминаля) широкого спектра действия, активный в отношении возбудителей колибактериоза в концентрации 7,8-15,6 мкг/мл.

2. Цидисепт-о относится к IV классу токсичности (малоопасные вещества - ГОСТ 12.1.007-76). ЛД 50 при внутрижелудочном введении превышает 30000 мг/кг массы тела, при введении его внутрь в максимально возможных объёмах (0,6 мл белым мышам и 6,0 мл белым крысам) в дозе 30 г/кг массы тела гибели животных не наступает. Препарат не обладает кумуляцией, раздражающими (слизистая глаз, кожа), аллергизирующими, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами.

3. Цидисепт-о не токсичен при хроническом применении. Введение препарата 21 день подряд с кормом белым крысам в терапевтической (0,5 мл/кг) и трёхкратной терапевтической (1,5 мл/кг) дозах не вызывает существенных изменений в клиническом состоянии животных, способствует приросту массы тела, величина которого зависит от дозы препарата, достоверно не влияет отрицательно на коэффициенты массы внутренних органов, гематологические и биохимические показатели.

4. Цидисепт-о в дозах 0,5 и 1,5 мл/кг массы тела не влияет негативно на структурную организацию печени, почек, легких, сердца, селезенки, семенников, тимуса и слизистой оболочки желудка белых крыс на 7-й, 14 и 21 день исследования. Наблюдаемые, при дозе препарата в 5 раз превышающую терапевтическую (2,5 мл/кг) и лишь на 21 день применения цидисепта-о, дистрофические процессы в печени, почках и слизистой оболочке желудка носили обратимый характер.

5. Применение цидисепта-о 2-3-месячным поросятам, в дозе 0,5 мл/кг массы тела 14 дней подряд, не влияет отрицательно на их клиническое состояние, морфо-биохимические показатели и способствует повышению привесов.

6. Остаточные количества циминаля выводятся из организма поросят через 7 суток после окончания применения препарата.

7. Применение цидисепта-о за 8-10 дней до опороса свиноматкам 5 дней подряд в дозе 0,5 мл/кг массы тела профилактирует колибактериоз у полученных от них новорожденных поросят.

8. Введение препарата с кормом, в дозе 0,5 мл/кг массы тела 5 дней подряд 14-дневным поросятам, профилактирует заболевание их колибактериозом на 90,2 %.

9. Использование цидисепта-о при колибактериозе поросят 7 дневного возраста в дозе 0,5 мл/кг массы тела в течение 7 дней способствует выздоровлению 87,5 % заболевших животных.

10. Терапевтическая эффективность цидисепта-о, при применении его больным колибактериозом поросятам в возрасте 26-29 дней в дозе 0,5 мл/кг массы тела в течение 7 дней составляет 80,0 %.

11. Применение цидисепта-о при колибактериозе телят в возрасте 2-7 дней способствует выздоровлению 70,0 % больных животных и сокращает сроки выздоровления на 0,2 дня.

12. Применение цидисепта-о в дозе 0,5 мл/кг массы тела в течение 6 дней обеспечивает терапевтическую эффективность (89,3%) при желудочно-кишечных болезнях бактериальной этиологии 1-2-месячных телят, протекающих с синдромом гастроэнтерита и сокращает сроки выздоровления на 0,5 дня.

13. Экономическая эффективность применения цидисепта-о на рубль затрат при профилактике колибактериоза поросят составляет 5,74 руб., при лечении колибактериоза поросят - 3,21 руб., при терапии колибактериоза телят - 14,71руб.


5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Для профилактики и лечения колибактериоза поросят и телят применять цидисепт-о внутрь 5-7 дней подряд в дозе 0,5 мл/кг массы тела.

2. Данные исследований по фармако-токсикологической оценке цидисепта-о и его лечебно-профилактической эффективности вошли в нормативно-техническую документацию по применению цидисепта-о в ветеринарии.

3. Основные положения диссертации могут быть использованы в учебном процессе на факультете ветеринарной медицины ВУЗов и колледжей по курсам фармакология с токсикологией и эпизоотологии.


СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТЦИИ


1. Индюков А.Л. Оценка острой токсичности препарата цидисепт-о / А.Л. Индюков // Матер. первого съезда ветер. фармакологов России. - Воронеж, 2007. – С. 302-304.

2. Беляев В.И. Субхроническая токсичность цидисепта-о / В.И. Беляев, Г.А. Востроилова, А.Л. Индюков // Фармакологические и экотоксические аспекты ветеринарной медицины: Матер. науч.-практ. конф. фармакологов РФ, посвященной 85-летию со дня рождения проф. Рабиновича М.И. - Троицк, 2007. – С.35-38.

3. Беляев В.И. Эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и влияние его на репродуктивные функции свиноматок / В.И. Беляев, А.Л. Индюков // Ветеринарная патология. – 2008. - № 2. - С.19-21.

4. Индюков А.Л. Эмбриотоксическое и тератогенное действие цидисепта-о – препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний телят и поросят / А.Л. Индюков, Ю.М. Косенко // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях: Матер. междунар. науч.- практ. конф. – Воронеж, 2008. - С.307-311.

5. Индюков А.Л. Параметры токсичности цидисепта-о – препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний телят и поросят / А.Л. Индюков, Ю.М. Косенко // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях: Матер. междунар. науч.- практ. конф. – Воронеж, 2008. - С.153-156.

6. Беляев В.И. Влияние цидисепта-о в различных дозах на клинико-биохимические показатели крыс / В.И. Беляев, Г.А. Востроилова, А.Л. Индюков // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Матер. междунар. науч.- практ. конф., посвящ. 65-летию Ульяновской ГСХА - Ульяновск, 2008. - Т. 3.– С. 9-11.

7. Фармако-токсикологические свойства и эффективность нового антибактериального препарата цидисепт-о / В.И. Беляев, Г.А. Востроилова, А.Л. Индюков, Ю.М. Косенко // Аграрный вестник Урала. – 2008. - № 8. - С.71-73.

8. Цидисепт-о – эффективный препарат при колибактериозе поросят / В.И. Беляев, Г.А. Востроилова, А.Л. Индюков, Ю.М. Косенко // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: Матер. междунар. науч.- практ. конф. - Москва, 2008. - С. 51-53.

9. Клинико-биохимические показатели у животных при длительном применении цидисепта-о / В.И. Беляев, Г.А. Востроилова, А.Л. Индюков, Ю.М. Косенко // Ветеринария и кормление. – 2008. - № 4. - С.15-16.


Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconЛечебно профилактическая эффективность пробиотика лаксубтил при колибактериозе телят 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconФармако-токсикологические свойства гепакардина и его применение в гериатрии 06. 02. 03 ветеринарная фармакология с токсикологией

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconФармакологическое обоснование применения тетраголда при колибактериозе поросят 06. 02. 03 ветеринарная фармакология и токсикология 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconФармако-токсикологическая характеристика энтерина 06. 02. 03 ветеринарная фармакология с токсикологией

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconФармако-токсикологическая характеристика тетраголда 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconФармако-токсикологическая и терапевтическая оценка новых лекарственных форм анандина 16. 00. 04 Ветеринарная фармакология с токсикологией

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconГемодинамические расстройства у поросят при колибактериозе и их коррекция 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconКлиническая фармакология линимента «ар-аз» в сочетании с иммуномодулятором «тамерит» при лечении хирургических ран собак 06. 02. 03 ветеринарная фармакология с токсикологией

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconАнтимикробная активность и лечебная эффективность комплексного препарата диоксинор при респираторных болезнях поросят 16. 00. 03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Фармако-токсикологические свойства и лечебно-профилактическая эффективность цидисепта-о при колибактериозе поросят и телят 16. 00. 04 ветеринарная фармакология с токсикологией iconАнтимикробная активность и лечебная эффективность тилоколина при бактериальных инфекциях органов дыхания поросят 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU