Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности icon

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности





Скачать 367.73 Kb.
НазваниеУдк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности
Дата конвертации25.05.2013
Размер367.73 Kb.
ТипДокументы
УДК 619:616.98:579.842.14


САЛЬМОНЕЛЛЫ: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРИСПОСОБЛЕННОСТИ И ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ


Д.Г. Ахметова1, Ж.А. Бердыгулова2, Е.Б. Евтыхова2, А.В. Шустов2


1 ГККП «Городская детская инфекционная больница», г. Астана

2 РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан», г. Астана

e-mail: shustov@biocenter.kz


Сальмонеллы вызывают весьма часто встречающиеся болезни у людей и животных, в связи с чем, являются причиной огромного морального и экономического ущерба. Повсеместное распространение антибиотикорезистентных штаммов сальмонелл становится всё более серьезной проблемой здравоохранения и ветеринарии. Огромное разнообразие рода Salmonella (более 2500 сероваров) в совокупности с патогенетическими и микроэкологическими особенностями разных штаммов привлекают внимание специалистов по молекулярной генетике бактерий.

Данный обзор содержит обсуждение классификации и номенклатуры сальмонелл, клинических особенностей, эпидемиологии, проблем антибиотикорезистентности и молекулярных детерминант вирулентности у данного рода энтеробактерий.

Ключевые слова: сальмонелла, классификация, клиника сальмонеллёзов, эпидемиология, устойчивость к антибиотикам, факторы вирулентности


Введение


Salmonella – род грамотрицательных, подвижных, факультативно анаэробных, палочковидных бактерий. Род Salmonella входит в состав обширного семейства Enterobacteriaceae (включает 50 родов).

Молекулярно-филогенетические исследования выявляют близкое родство сальмонелл с другими родами кишечных бактерий, в частности, с наиболее хорошо изученным родом бактерий - Escherichia, причём дивергенция Salmonella и Escherichia произошла примерно 102 млн. лет назад [1].

Местом преимущественного размножения сальмонелл является кишечник разнообразных животных (как позвоночных, так и беспозвоночных) и человека. Не смотря на высокую частоту выявляемости сальмонелл в пробах микрофлоры тонкого кишечника позвоночных, по крайней мере для теплокровных, эти бактерии всегда являются патогенными (с вариабельной вирулентностью), и вызывают у хозяина самоограничивающуюся инфекцию. Сальмонеллы могут длительное время выживать в окружающей среде внутри вакуолей свободноживущих одноклеточных эукариот [2]. Сальмонеллы могут инфицировать и растения, при этом они размножаются внутри вакуолей растительных клеток [3]. Так, в условиях теплиц сальмонеллы, попавшие в почву, способны вызывать инфекцию у проростков растений, и затем длительное время (до уборки урожая) персистируют в растительных клетках [3, 4].


Классификация и номенклатура


Согласно современной классификации, род Salmonella состоит из двух видов: S. entericа и S. bongori, шести подвидов (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae и indica) и огромного количества сероваров (в настоящее время выделено 2579 сероваров; из этого количества к S. bongori относятся всего 20 сероваров) [5]. Изоляты S. entericа выделяют преимущественно от теплокровных животных, и почти все (99%) случаи сальмонеллёза у человека вызваны S. entericа. Изоляты S. bongori выделяют в основном от холоднокровных, к этому виду относятся менее 1% клинических изолятов.

Исторически сложившаяся система подвидовых имён и названий сероваров или штаммов (номенклатура) сальмонелл восходит корнями ко времени, когда изоляты называли по месту выделения. Для удобства пользования номенклатурой подвидовое имя часто опускают и используют вместо него название серовара (с большой буквы), например, S. enterica серовар typhimurium может фигурировать как S. typhimurium.

Широко применяемая в настоящее время классификация сальмонелл основана на изучении чувствительности изолятов к выбранным бактериофагам, что известно как фаготипирование. Для фаготипирования доступен международный стандартный набор из 36-ти бактериофагов сальмонелл, который позволяет определить более 200 фаготипов (definitive phage type).

Фаготипирование рутинно используется для решения эпидемиологических задач - когда необходимо проследить эпидемическую цепочку и определить источник вспышки [6].

Эпидемиологическая в своей основе система классификации использует специфичность сальмонелл по отношению к определённому кругу хозяев. Было обнаружено, что некоторые серовары сальмонелл (ограниченные по хозяину, host-restricted) способны колонизировать единственный вид организма-хозяина. Так, человек является единственным природным хозяином и резервуаром для сероваров Typhi и Paratyphi A. У людей указанные серовары вызывают системные инфекции - брюшной тиф и паратиф. Другая группа сероваров (адаптированные к хозяину, host-adaptated) включает сальмонеллы, преимущественно выделяемые от одного вида или двух близкородственных видов хозяев, но также способные вызывать заболевание у других видов. Серовары Gallinarum и Pullorum выделяют от птиц; серовар Dublin вызывает тяжёлую системную инфекцию у крупного рогатого скота и может вызвать болезнь у человека; аналогична ситуация с сероварами Choleraesuis и Typhisuis (выделяемыми от свиней) и с сероваром Abortusovis (от овец) [7]. Сальмонеллы, ограниченные по хозяину или адаптированные к определённому виду хозяина, как правило, не могут расти на минимальной среде без факторов роста, в отличие от убиквитарных сальмонелл. Убиквитарные (повсеместно распространённые) серовары не ассоциированы с определённым хозяином и могут инфицировать неродственные виды. В действительности, именно убиквитарные серовары ответственны за большую часть клинических случаев сальмонеллёза. Так, наиболее часто выделяемые от людей изоляты сальмонелл относятся к убиквитарным сероварам Enteritidis, Typhimurium и Heidelberg [8].

Система классификации Кауфмана-Уайта (Kauffmann-White) опирается на антигенные различия сероваров. Важные для серотипирования, иммунодоминантные антигены сальмонелл получили обозначения О, Н и K (у высоковирулентных сероваров сальмонелл K-антиген часто называют Vi-антигеном) [5].

В настоящее время известно, что антиген O («соматический») представляет собой липополисахарид (LPS) внешней мембраны. O-антиген состоит из повторяющихся олигосахаридных последовательностей (по 3-8 моносахаридов в каждой). Различия между O-антигенами вызваны разными последовательностями моносахаридных звеньев и разными гликозидными связями между моносахаридами. К числу O антигенов относятся группоспецифические антигены и дополнительные антигены. Большинство изолятов сальмонелл (>95%), выделенных от человека, могут быть классифицированы по группоспецифическим антигенам O на пять групп (антигенных комплексов): A, B, C, D и E. Дополнительные антигены выделяют серотипы в пределах группы. Любой изолят сальмонелл относится только к одной группе и может иметь или не иметь дополнительные O-антигены.

Антиген H («жгутиковый») представляет собой поверхностные домены бактериального белка флагеллина, образующего жгутики. Бактериальная клетка сальмонеллы в большинстве случаев несёт 6-10 жгутиков. Сальмонеллы демонстрируют сильное популяционное разнообразие в участках генов, кодирующих поверхностные домены флагеллина, что фенотипически проявляется в серологическом разнообразии H-антигенов. Кроме межштаммовых различий, ещё одним источником вариабельности по антигенам H является явление «смены фаз» в пределах одного штамма. Большинство штаммов сальмонелл (двухфазные штаммы) могут производить два разных флагеллина (получивших названия H1 и H2), причём в любой момент времени бактерия экспрессирует только один тип флагеллина (H1 или H2). Соответственно, в геноме сальмонеллы присутствуют два разных гена флагеллина (fljB для H2, и fliC для H1), причём у некоторых штаммов fljB кодирует дефектный флагеллин, не образующий жгутики. Ген fljB входит в состав оперона (оперон - участок ДНК, содержащий совместно транскрибируемые гены) fljBA, который, кроме флагеллина, кодирует ещё белок FljA. В свою очередь FljA является белком-репрессором для гена второго флагеллина (fliC). Промотор для конститутивной экспрессии имеется только у оперона fljBA (ген fliC имеет собственный репрессируемый промотор). В результате такой организации системы генов, экспрессия оперона fljBA приводит к синтезу флагеллина H2 и подавлению синтеза флагеллина H1. Молекулярный механизм смены фаз у сальмонелл предусматривает спонтанную перестройку (инверсию) в геноме бактерии. Промотор оперона fljBA фланкирован инвертированными повторами, между которыми возможна гомологическая рекомбинация. Такая рекомбинация действительно происходит (с частотой 10^(-3)-10^(-5) событий на генерацию, что существенно превышает частоту спонтанных мутаций) и приводит к инверсии сегмента ДНК, содержащего промотор оперона fljBA. В результате инверсии оперон fljBA переходит из активного (фаза H2) в неактивное состояние (фаза H1) или наоборот. Ген fliC активируется в фазу H1 и подавляется в фазу H2. Смена фаз, вероятно, является адаптацией для «уклонения» от иммунного ответа, поскольку флагеллин является сильным антигеном, и сальмонеллы вынуждены взаимодействовать с иммунной системой из-за присущих им способности к инвазии и системной инфекции [9]. Штаммы сальмонелл с дефектным геном fljB в фазе H2 не имеют жгутиков и поэтому неподвижны. Бактериальная клетка дольше времени находится в фазе H2. Существование смены фаз приводит к тому, что для серотипирования штамма по антигенам H требуется индуцировать образование в культуре фазы H1, для чего применяется выращивание на полужидком «агаре роения» или в сосуде, содержащем одновременно агаризованную и жидкую среду.

Серотипирование сальмонелл обыкновенно сводится к определению O-антигенов, в первую очередь группоспецифических, затем дополнительных, после чего определяют H-антигены для обеих фаз. Для серотипирования сальмонелл на смену моноспецифическим сывороткам пришли панели группо- и типоспецифических моноклональных антител («энтероклонов»).

Другой иммунодоминантный антиген сальмонелл - антиген K («капсульный») - представляет собой гомополимер N-ацетилгалактозаминуроновой кислоты, из которого состоит внешняя нерастворимая оболочка бактериальной клетки (капсула). В течение определённого времени считали, что наличие капсульного антигена является признаком вирулентных штаммов, поэтому для наиболее вирулентных сальмонелл (сероваров Typhi, Paratyphi C, и некоторых штаммов серовара Dublin) капсульный антиген получил назвние Vi-антигена (от слова «virulence»). Определение наличия Vi-антигена проводится путём фаготипирования с Vi-фагами [10].

Методы построения молекулярных филогений путём сравнения нуклеотидных последовательностей предоставили исследователям возможность создания генетической классификации сальмонелл. Филогенетические деревья, построенные для последовательностей 16S рибосомных РНК, подтверждают обоснованность деления рода Salmonella на два вида. Кроме этого, для абсолютного большинства последовательностей S. enterica наблюдают группирование в шесть монофилетических групп (т.н. клад), получивших обозначения римскими цифрами и латинскими буквами. Кладистическая систематика, основанная на молекулярных филогениях, хорошо соответствует традиционной систематике, основанной на фаго- и серотипировании, а именно: подвид enterica (клада I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) и indica (VI) [6].


Клинические формы сальмонеллёза


Сальмонеллёзы могут протекать в широком спектре клинических форм. Серовар Enteritidis вызывает у человека гастроэнтериты, кишечные лихорадки (брюшной тиф, паратифы), генерализованную инфекцию (тифоподобную или септикопиемическую) и бессимптомную инфекцию по типу носительства.

Серовар Typhi является этиологической причиной брюшного тифа, а серовар Paratyphi (подтипов A, B и C) вызывает паратиф, - похожую по клинической картине болезнь с несколько ослабленной симптоматикой и меньшей смертностью. Брюшной тиф и паратиф всегда протекают с бактериемией и системной инфекцией, причём жизнеспособные сальмонеллы выявляются в органах ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), прежде всего в мезентериальных лимфоузлах и селезёнке. Обычная симптоматика при кишечных лихорадках включает продолжающийся в течение нескольких дней подъём температуры, задержку стула (которая иногда сменяется диареей), гепато- и спленомегалию, общую интоксикацию, олигурию, сыпь (брюшнотифозные розеолы). При тяжелом течении возможны кишечные кровотечения, перфорация кишечника, поражения в органах за пределами ЖКТ (инфекционно-токсическая энцефалопатия – «тифозный статус», пневмония, остеомиелит и менингит). До 10% выздоравливающих пациентов испытывают острые рецидивы, вероятной причиной которых является персистенция сальмонелл в РЭС.

Нетифоидные серовары вызывают гастроэнтериты, сильно варьирующие по степени тяжести но, как правило, самоограничивающиеся. Острый сальмонеллёзный гастроэнтерит характеризуется лихорадкой с ознобом, рвотой, диареей без крови, болезненными спазмами кишечника. Нетифоидный сальмонеллёз также может сопровождаться системной инфекцией и, примерно в 8% случаев, при отсутствии своевременно начатого лечения антибиотиками, протекает с бактериемией (возбудитель выявляется в крови). Частота системной инфекции зависит от серовара: к числу высокоинвазивных сероваров относятся Cholearaesuis и Dublin.

Состояние хронического носительства сальмонелл определяется как выделение микроорганизма с фекалиями в течение более 1 года после инфицирования. Факторы, способствующие установлению носительства, мало изучены, однако наблюдается зависимость от серовара. Из числа нелеченных антибиотиками случаев брюшного тифа 10% заболевших выделяют S. Typhi с фекалиями в течение 1-3 мес. и 2-5% становятся хроническими носителями. Известно, что местом персистенции возбудителя при носительстве S. Typhi является желчный пузырь. Нетифоидные серовары персистируют в желудочно-кишечном тракте теплокровных в среднем 1,5-3 мес., и лишь в 0,1% случаев устанавливается носительство. Содержание сальмонелл в фекалиях носителей достаточно велико, чтобы поддерживать эндемическую циркуляцию и вызывать спорадические вспышки.


Эпидемиология


Брюшной тиф и паратиф редки в развитых странах, где регистрируются редкие вспышки, происходящие из одного источника, и отмечаются отдельные случаи у людей, недавно приехавших из стран с низкими стандартами санитарии. Брюшной тиф и паратиф передаются через пищу и воду, контаминированные фекалиями больных людей. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) оценивает заболеваемость брюшным тифом в мире в 16-17 миллионов случаев в год. В условиях неадекватного лечения смертность от брюшного тифа составляет 5-30%, в частности, по данным ВОЗ, 600 тысяч человек погибает в год от брюшного тифа [11].

Не менее 150-ти сероваров сальмонелл могут вызывать нетифоидный сальмонеллёз (НТС) у человека, причём существуют устойчивые межрегиональные различия в частотах встречаемости разных сероваров в клинике и доминирующих сероварах. В странах Северной Америки наиболее частыми возбудителями НТС являются серовары Typhimurium, Enteritidis, Newport, Heidelberg, Javiana [12]. В странах Евросоюза доминирует серовар Enteritidis. В Юго-Восточной Азии большая часть заболеваемости вызвана сероваром Choleraesuis [13]. Адаптированные серовары (например, Dublin, Choleraesuis), циркулируют у продуктивных животных и птиц, а вызванные ими случаи инфекции у человека, как правило, имеют источником обсеменённую пищевую продукцию. В 95% случаев НТС связан с потреблением контаминированной пищи. В случае убиквитарных сероваров (например, Typhimurium, Enteritidis, Virchow и Hadar), передача возбудителя может происходить через пищу и воду, контаминированные фекалиями позвоночных животных, или контактным способом при прямых контактах с животными и птицами. Прямые контакты с животными и птицей являются существенным фактором риска НТС для людей, работающих в аграрном производстве. Характерной особенностью вспышек, эпидемиологически связанных с продукцией птицеводства, является принадлежность возбудителя к «птичьим» сероварам Pullorum и Gallinarum [14]. Растения также являются эпидемиологически значимым источником сальмонелл. В развитых странах эпидемиологические расследования случаев гастроэнтерита, происходящих примерно в одно и то же время, но не являющихся членами одной эпидемической цепи, часто идентифицирует в качестве причины заражения употребление людьми в пищу нетермообработанной растительной пищевой продукции, выращенной в одной теплице или из одной рассады. Были выявлены случаи использования в теплицах контаминированных сальмонеллами удобрений, и обнаружено, что сальмонеллы, в случае их попадания в почву, инфицируют ряд культур (например, салат-латук) ещё во время эмбриогенеза растений, после чего эти бактерии способны размножаться и персистировать внутри растительных клеток [15].

По данным ВОЗ, заболеваемость НТС во всём мире превышает 1 млрд. случаев в год, а смертность от НТС - 3 млн. случаев в год [11]. Эти данные являются экстраполированными оценками, поскольку считается, что лишь от 1 до 10% случаев попадают в официальную регистрацию. НТС не является проблемой исключительно развивающихся стран. Так, в США заболеваемость НТС оценивается в 1,4 млн. случаев в год, что составляет 26% от всех случаев пищевых токсикоинфекций в этой стране [16].

Инфекционная доза сальмонелл, вызывающая клинически выраженную болезнь у определённой доли инфицированных (например, у 50% инфицированных - ID50), зависит от способа введения, серовара, физиологического статуса бактерий и, в огромной степени – от восприимчивости хозяина, включая возраст хозяина, напряжённость иммунитета и состояние ЖКТ. В разных условиях ID50 для сальмонелл при пероральном введении варьирует в диапазоне от 30 до 10^9 колониеобразующих единиц (КОЕ). Расследование вспышек сальмонеллёза, имевших один источник в виде контаминированной пищи с низкой степенью обсеменённости, показали, что в ряде случаев болезнь была вызвана вероятной инфекционной дозой всего 10 КОЕ [10].

Доминирующий способ передачи сальмонеллёзов у людей - фекально-оральный. В то же время сальмонеллы являются не только человеческими, но и важными ветеринарными патогенами, и в этой связи интересно, что у животных описаны и другие пути передачи, кроме фекально-орального, которые в конечном счёте также приводят к колонизации ЖКТ. У крупного рогатого скота и свиней входными воротами инфекции могут быть респираторный тракт и миндалины. После развития локального очага в месте первичной колонизации сальмонеллы распространяются по организму животного с кровью и лимфой.


Устойчивость к антибактериальным препаратам


Исторически термин «антибиотик» относится к веществам биологического происхождения или их полусинтетическим производным, способным подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель. Примерами антибиотиков являются β-лактамы (ценициллины, карбапенемы, цефалоспорины), аминогликозиды, макролиды, тетрациклины. Помимо антибиотиков, в вышеприведённом определении для подавления бактериального роста применяют синтетические вещества, не имеющие аналогов в живой природе (сульфаниламиды, хинолоны, имидазолы и др.). В данной статье чистые вещества, используемые для лечения сальмонеллёзов, называются антибактериальными препаратами (АБП).

Первый опыт лечения сальмонеллёзов антибиотиком (хлорамфениколом) в 1948 г. был очень успешным. АБП, применяемые в настоящее время по характерной фармакокинетике, можно классифицировать на три группы: 1) препараты, не обладающие заметной адсорбцией в кишечнике (например, неомицин и колистин); 2) кишечно-адсорбируемые антибиотики широкого спектра действия, которые не проникают внутрь эукариотических клеток и не обладают заметной внутриклеточной активностью (ампициллин, амоксициллин, хлорамфеникол, тетрациклин, котримоксазол); 3) кишечно-адсорбируемые АБП, обладающие выраженной внутриклеточной (внутри клеток хозяина) активностью (5-фторхинолоны). За последние десятилетия для перечисленных групп АБП, включая все препараты первого поколения для лечения сальмонеллёзов (ампициллин, хлорамфеникол, триметоприм/сульфаметоксазол) и второго поколения (5-фторхинолоны, цефалоспорины расширенного спектра), были обнаружены соответствующие антибиотикорезистентные штаммы сальмонелл.

Антибиотики оказались востребованы не только в медицине и ветеринарии, они получили широчайшее распространение в животноводстве и птицеводстве, где используются при откорме в качестве т.н. «промоторов роста». Вероятно, по этой причине современные циркулирующие штаммы сальмонелл обыкновенно резистентны к антибиотикам первой линии (ампициллин, хлорамфеникол, триметоприм-сульфаметоксазол). Описано появление и установление циркуляции мультирезистентных штаммов (multi-drug resistant, MDR). Так, в США и странах Европы была детально задокументирована временная динамика распространения в популяциях домашних животных и человека мультирезистентного фенотипа ACSSuT (такая аббревиатура обозначает устойчивость одновременно к ампициллину (A), хлорамфениколу (C), стрептомицину (S), сульфонамидам (Su) и тетрациклинам (T). Указанный MDR-фенотип был впервые обнаружен в середине 1980-х гг. Всего за одно десятилетие после обнаружения изоляты S. Typhimurium фаготипа DT104 резистентного фенотипа ACSSuT стали доминировать в ветеринарных образцах и выявлялись в 10% случаев сальмонеллёза у людей в США и Великобритании [17].

Известно несколько типов молекулярных механизмов резистентности к АБП, а именно: продукция ферментов, инактивирующих препарат посредством биохимической модификации его структуры, снижение проницаемости для препарата цитоплазматической мембраны бактерии, приобретение или увеличение активности молекулярных помп (насосов) для эффлюкса (активного удаления препарата из клетки во внешнюю среду) и изменение природных мишеней действия препарата [18].

Устойчивость к бета-лактамным антибиотикам, в первую очередь к пенициллинам, а также цефамицину и карбопенему у грамотрицательных бактерий обычно вызвана продукцией фермента бета-лактамазы [19]. Известно 4 класса бета-лактамаз (классы A-D), из которых классы A, C, и D содержат в активном центре каталитически активный остаток серина, а класс B представлен цинк-зависимыми металлолактамазами. У сальмонелл наиболее часто резистентность вызвана бета-лактамазами TEM и SHV, относящимися к классу A и закодированными в плазмидах [20].

Приобретенная резистентность к аминогликозидам (канамицину, стрептомицину, гентамицину) вызвана ферментами, инактивирующими аминогликозиды [21]. Известно три класса таких ферментов: аминогликозид фосфотрансферазы, аминогликозид нуклеотидилтрансферазы и аминогликозид ацетилтрансферазы. Аминогликозид фосфотрансфераза кодируется геном aphA, обыкновенно отвечает за устойчивость к канамицину, переносит фосфатный остаток с молекулы АТФ на гидроксильную группу молекулы аминогликозида. Аминогликозид ацетилтрансфераза кодируется геном aacC и обеспечивает устойчивость к гентамицину, переносит радикал CH3COO- с ацетил-коэнзима А на аминогруппу антибиотика. Аминогликозид аденилтрансферазы, кодируемые генами aadA и aadB, отвечают за устойчивость соответственно к стрептомицину и гентамицину. Эти ферменты гидролизуют молекулу АТФ с высвобождением пирофосфата и переносят остаток адениловой кислоты (АМФ) на гидроксильную группу антибиотика. В результате такой модификации антибиотик теряет способность связываться с внутриклеточной мишенью – бактериальной рибосомой. Гены, кодирующие перечисленные ферменты, как правило, локализуются в плазмидах [22].

Механизм резистентности, заключающийся в изменении внутриклеточных мишеней действия антибиотика, работает в случае резистентности к хинолонам и фторхинолонам. Соответствующие резистентные штаммы сальмонелл имеют мутации в генах, кодирующих фермент ДНК-гиразу (топоизомеразу II). ДНК-гиразы у всех клеточных организмов выполняют незаменимые функции, заключающиеся в поддержании топологически напряжённого (суперскрученного) состояния ДНК, что требуется для репликации и транскрипции. Мутации в гене гиразы приводят к изменениям в структуре фермента, которые предотвращают связывание антибиотиков.

Большая часть случаев резистентности к тетрациклину и хлорамфениколу связаны с активностью молекулярных помп, которые обеспечивают эффлюкс (отток токсичных для бактериальной клетки соединений во внешнюю среду). Молекулярные помпы, специфичные к тетрациклину и хлорамфениколу, кодируются генами tet и floR(cml), соответственно [23]. Известен и другой механизм резистентности к хлорамфениколу, связанный с активностью фермента хлорамфеникол ацетилтрансферазы, закодированной в гене cat. Другим примером модификации мишени для ослабления действия антибиотика является резистентность к триметоприму и сульфаниламидам. Указанные антибиотики являются конкурентными ингибиторами ферментов биосинтеза фолиевой кислоты - дигидрофолатредуктазы (мишень триметоприма) и дигидроптероат синтетазы (мишень сульфаниламидов). Резистентность к триметоприму обыкновенно связана с приобретением бактерией плазмиды, содержащей ген dhfr, а устойчивость к сульфаниламидам вызвана плазмидами с генами sulI или sulII. Перечисленные гены кодируют соответствующие ферменты со сниженной аффинностью к антибиотикам.


Механизмы распространения резистентности


Открытие антибиотиков и явления антибиотикорезистентности у бактерий имело фундаментальное значение как для медицины, так и для молекулярной генетики и, в частности, привело к обнаружению природных мобильных элементов, в том числе транспозонов и конъюгативных плазмид. В настоящий момент известно, что у микроорганизмов гены устойчивости к антибиотикам, как и гены катаболизма ксеногенных химических веществ, наиболее часто присутствуют на дополнительных (присутствующих не у всех представителей вида) элементах генома – плазмидах, транспозонах и интегронах. При этом в генетических системах, обеспечивающих резистентность, имеются общие для большинства видов бактерий закономерности и прослеживается иерархия молекулярной организации. У мультирезистентных штаммов гены устойчивости к разным АБП обыкновенно оказываются расположенными в непосредственной близости друг от друга (сгруппированы в генные кассеты). Генные кассеты часто оказываются расположены внутри особых последовательностей (генетических элементов) - транспозонов и интегронов. Транспозоны - мобильные генетические элементы, они кодируют функции, позволяющие им перемещаться по геному. Транспозоны спорадически встречаются в бактериальной хромосоме или присутствуют в составе плазмид (каждая плазмида несёт единственную копию мобильного элемента определённого типа или по одной копии мобильных элементов разных типов). Дополнительные элементы генома легко приобретаются и теряются бактерией-хозяином, а присущие им молекулярные механизмы обеспечивают непрерывное накопление разнообразия генотипов в популяциях.

Передача генов устойчивости может происходить вертикально (при делении, от родительской клетки к ее потомкам) или горизонтально (от бактерии-донора к бактерии-реципиенту, в случае, когда реципиент не является потомком донора). У бактерий описаны три механизма горизонтального переноса генов: конъюгация, трансдукции и трансформация. Конъюгация – парасексуальный процесс, при котором две бактериальные клетки непосредственно контактируют между собой с помощью особой белковой структуры (половых пилей) и происходит однонаправленный перенос части генетического материала (включая плазмиды и часть бактериальной хромосомы). Трансдукция – перенос хозяйских генов при помощи бактериофагов. Трансформация предусматривает поглощение свободной ДНК (например, геномной ДНК, высвободившейся из погибших бактерий) из среды в клетку, с последующим включением фрагментов захваченной ДНК в состав хромосомы реципиента. Среди перечисленных процессов, конъюгация способна обеспечить передачу наибольшего количества генетической информации (сотни генов), что связано с существованием высокоэффективных природных систем, инициирующих и осуществляющих данный процесс [24].

Плазмиды - внехромосомные молекулы ДНК длиной от 2 тыс. до 250 тыс. пар оснований (это значительно меньше хромосомы бактерии), способные к автономной репликации. Среди дополнительных элементов генома плазмиды были обнаружены исторически первыми. Большинство известных плазмид, в том числе все известные в настоящее время плазмиды сальмонелл - кольцевые молекулы. Все плазмиды содержат сайт инициации репликации (т.н. ориджин репликации, обозначаемый oriV), а некоторые плазмиды имеют собственный ген белка инициации репликации (TrfA). Многие крупные плазмиды также имеют гены, обеспечивающие контроль копийности и стабильность наследования (последние обеспечивают равномерную сегрегацию – распределение молекул ДНК в дочерние клетки при делении бактерии). Кроме перечисленных функций, т.н. конъюгативные плазмиды несут гены систем конъюгативного переноса. Системы конъюгативного переноса включают в себя примерно 40 генов, в том числе участок ДНК, с которого начинается перенос плазмиды (т.н. ориджин переноса, обозначаемый oriT), гены белков половых пилей (trbC), белков конъюгативной поры, никазы (traI) и релаксазного комплекса (traJ, traK). Никаза вносит разрыв в одну из цепей ДНК плазмиды в области oriT, а релаксаза переносит одноцепочечную ДНК к поре в клеточной стенке, через которую осуществляется передача ДНК в другую клетку. Кроме перечисленных групп генов, необходимых для репликации и поддержания плазмиды в клетке, весьма часто плазмиды несут дополнительные гены, обеспечивающие бактерии селективное преимущество в токсичной среде или в условиях стресса: гены устойчивости к антибиотикам, тяжёлым металлам, гены деградации ксеногенных химических веществ. Плазмиды, несущие гены резистентности к АБП, получили общее название R-плазмид (от слова «resistance»).

Плазмиды обычно классифицируют по группам несовместимости (Inc-группы, от слова «incompatibility»). Явление несовместимости заключается в неспособности двух родственных плазмид стабильным образом поддерживаться в одном клоне, что объясняется конкуренцией за общие элементы управления репликацией или сегрегацией. Каждая группа несовместимости объединяет плазмиды с одинаковыми или похожими oriV. В пределах групп существует деление на типы, отражающее филогенетическое родство последовательностей oriV, и (если есть) генов систем конъюгативного переноса. Большинство известных плазмид грамотрицательных бактерий могут быть классифицированы в четыре группы несовместимости: группа IncF (включает типы IncF, IncS, IncC, IncD и IncJ), группа IncP (типы IncP, IncU, IncM и IncW), группа Ti (типы IncX, IncH, IncN и IncT) и группа IncI (типы IncI, IncB и IncK). Принадлежность к определённой группе несовместимости определяет спектр возможных хозяев плазмиды, например, плазмиды группы IncF встречаются только у бактерий сем. Enterobacteriaceae. R-плазмиды в принципе могут принадлежать к любой группе несовместимости, но большинство R-плазмид сальмонелл принадлежит к IncF.

Дополнительные гены плазмид, кодирующие резистентность к АБП, чаще всего находятся в мобильных генетических элементах: сложных транспозонах, простых транспозонах и интегронах.

Из числа первых описанных мобильных генетических элементов, несущих гены устойчивости к антибиотикам, многие оказались сложными транспозонами. Так, транспозон Tn9 кодирует устойчивость к хлорамфениколу (catA); Tn10 – устойчивость к тетрациклину (tet); Tn5 - устойчивость к канамицину (kan), блеомицину (ble) и стрептомицину (str) (рис. 1).

Сложные транспозоны состоят из фрагмента ДНК, окружённого с флангов т.н. IS-элементами. IS-элементы (также известные как «вставочные последовательности», «insertion sequences») являются простейшими мобильными элементами ДНК. Функционально активный IS-элемент имеет только ген транспозазы - фермента, обеспечивающего мобильность, и не содержит генов с фенотипическими проявлениями. Транспозаза связывается со специфическими сайтами узнавания на концах IS-элемента, вырезает IS-элемент (сшивая образовавшийся разрыв в ДНК), после чего осуществляет вставку вырезанного IS-элемента в другое место в плазмидной или хромосомной ДНК. Когда два одинаковых IS-элемента фланкируют фрагмент ДНК (один ген устойчивости или целую генную кассету), транспозаза может провести вышеописанное перемещение со всем указанным фрагментом, который в этом случае является сложным транспозоном.

Простые транспозоны (pис. 1) не несут на концах IS-элементов, а вместо них имеют короткие инвертированные повторы. Простые транспозоны кодируют собственную транспозазу (tnpA) и второй фермент – резолвазу (tnpR), а также имеют в своей последовательности один сайт узнавания для резолвазы (сайт res). Миграция простых транспозонов происходит по механизму репликативной транспозиции. В данном механизме транспозаза вносит одноцепочечные разрывы на концах транспозона (в разных цепях ДНК). Этот же фермент вносит разрыв в месте будущей встройки транспозона (акцепторный сайт) в другом участке ДНК и соединяет концы цепей так, чтобы в итоге получилась структура, подобная репликативному интермедиату (с двумя репликативными вилками, направленными навстречу друг другу). Затем происходит репликация участка ДНК, содержащего простой транспозон и образование коинтеграта – структуры, в которой две копии транспозона (в донорной и акцепторной молекулах ДНК) связаны между собой. После этого резолваза осуществляет сайт-специфическую рекомбинацию по сайту res, что расцепляет донорную и акцепторную молекулы, в каждой из которых остаётся по копии транспозона [25].




Рис. 1. Генетическая организация транспозонов. Сложные транспозоны состоят из одного или нескольких структурных генов, окружённых т.н. вставочными последовательностями (IS) в прямой ориентации (Tn9) или обратной ориентации (Tn5, Tn10). Простые транспозоны имеют на концах короткие инвертированные повторы. Tn3 имеет два гена транспозиции (tnpA, tnpR) и один ген бета-лактамазы (bla); Tn7 несёт пять генов транспозиции (tnsABCDE) и содержит в своём составе интегрон с генами устойчивости к стрептотрицину (sat), аминогликозидам (aadA1) и канамицину (ybeA).


К началу 1980-х гг. было накоплено большое количество данных по бактериальным плазмидам и была открыта возможность существования вариантов одной и той же плазмиды, несущих разные гены резистентности. При этом, описанные варианты были совершенно идентичны друг другу в других участках плазмидной ДНК (за пределами генов резистентности). Обнаруженное разнообразие таких вариантов позволяло предположить существование механизма обмена структурными генами между молекулами ДНК с участием сайт-специфической рекомбинации. Дальнейшее изучение таких плазмид привело к открытию интегронов – генетических элементов, способных включать (захватывать) в свой состав открытые рамки считывания (open reading frame, ORF, белок-кодирующие последовательности), накапливать их в генные кассеты и экспрессировать генные кассеты с собственного промотора. Интегроны обладают механизмом, позволяющим им эффективно обмениваться между собой генными кассетами. Данный механизм придаёт интегронам функциональность мобильных генетических элементов, только мобильностью в данном случае обладает не весь генетический элемент, а его часть – генная кассета.

Интегрон включает в себя 5'-консервативную последовательность (5'-CS), вариабельную генную кассету и 3'-консервативную последовательность (3’-CS) (рис. 2). В структуре 5'-CS имеется ген intI (кодирующий фермент интегразу) под контролем промотора Pint. Кроме этого в 5'-CS присутствует сайт для вставки привносимых фрагментов ДНК (сайт attI) и промотор, направляющий экспрессию вставочной генной кассеты (промотор Pc) (рис. 2). Область 3'-CS содержит палиндромный фрагмент длиной 59 пн, называемый 59-членной последовательностью (59-be) или сайтом рекомбинации (сайт attC) [25]. Если генная кассета содержит несколько ORF, последние отделяются друг от друга консервативными 59-членными последовательностями. Интеграза IntI осуществляет рекомбинацию между сайтом attI интегрона и сайтом attC генной кассеты, что приводит или к вырезанию из интегрона предшествующей генной кассеты, или вставке в интегрон другой генной кассеты [25]. В случае вырезания генной кассеты, продуктами такой активности интегразы являются укороченный интегрон и кольцевая молекула ДНК, содержащая ORF генов резистентности, но которая транскрипционно неактивна и неспособна к самостоятельной репликации. Данный кольцевой фрагмент ДНК может деградировать в клетке или встроиться в другое место в геноме, в другой интегрон того же класса. В ДНК бактериальной хромосомы и в больших плазмидах присутствуют множество интегронов, несущих разнообразные генные кассеты, а процессы горизонтального переноса генов приводят к внутривидовой и межвидовой мобильности генных кассет.




Рис. 2. Система интегрон – генная кассета. Интеграза, закодированная в гене intI, осуществляет гомологическую рекомбинацию между сайтами attI и attC. Рекомбинация с участием генной кассеты, находящейся в форме свободной кольцевой молекулы ДНК, приводит к встройке данной генной кассеты в состав интегрона. Рекомбинация между сайтами attI и attC, находящимися в одной молекуле ДНК, приводит к высвобождению генной кассеты в виде кольцевой молекулы ДНК.


Колонизация и адгезия


Заражение сальмонеллами происходит преимущественно через контаминированные пищу и воду. Это означает, что сальмонеллы должны сохранять жизнеспособность в кислой среде желудка, а также выдерживать высокое содержание желчных кислот в содержимом 12-перстной кишки до того, как сальмонеллы достигнут участков ЖКТ, пригодных для колонизации (тонкий кишечник, толстая и слепая кишки). В геноме сальмонелл закодирован набор белков кислотного шока (ACP, от «acid shock proteins»), в том числе белки RpoS, PhoPQ и Fur [26]. RpoS и PhoPQ важны для выживания при низких значениях рН, созданных неорганическими кислотами; RpoS и Fur обеспечивают толерантность к органическим кислотам. Белки ACP управляют экспрессией молекулярных шаперонов, факторов транскрипции и трансляции, белков внешней мембраны и фимбрий [26].

Для патогенности сальмонелл особое значение имеет способность к адгезии – специфическому связыванию с апикальными (обращёнными в просвет кишечника) поверхностями энтероцитов. Адгезия происходит при участии фимбрий и пилей, присутствующих на внешней мембране бактерий. У сальмонелл есть несколько типов фимбрий, в том числе фимбрии 1-го типа (Fim), длинные полярные фимбрии (Lpf), тонкие агрегативные фимбрии (необходимы для образования биоплёнок сальмонелл) и фимбрии, закодированные в плазмидах (Pef). Разные типы фимбрий демонстрируют тканевый тропизм. Фимбрии 1-го типа наименее специфичны и способны связываться со звеньями альфа-D-маннозы в структуре гликолипидов на поверхностях эукариотических клеток разнообразных клеточных типов. Структурные компоненты фимбрий 1-го типа закодированы в семи генах (fimAICDHF), в частности, основным структурным белком является FimA, а FimH непосредственно обеспечивает прикрепление к гликолипидному рецептору. Фимбрии Lpf связываются с поверхностью пейеровых бляшек и М-клеток, фимбрии Pef связываются с каёмчатыми энтероцитами [27].


Патогенез и способность к инвазии


Характеристикой сальмонелл, в наибольшей степени определяющей патогенез вызываемой ими инфекции, является инвазивность. Инвазивность сальмонелл - это способность бактерии проникать из мест колонизации кишечной трубки во внутреннюю среду организма-хозяина. Сальмонеллы - факультативные внутриклеточные паразиты, которые могут внедряться в разные типы клеток, выживать во внутриклеточной среде, избегая природных механизмов уничтожения фагоцитированных микробов, и распространяться по организму внутри циркулирующих клеточных типов (т.н. трансмиграция). Инвазия начинается с адгезии – прикрепления сальмонелл к апикальным (обращённым в просвет кишечника) мембранам энтероцитов и M-клеток абсорбтивного эпителия, чаще всего в дистальных отделах тонкого кишечника. Далее сальмонеллы проникают внутрь клеток (клеточная инвазия), мигрируют между разными клетками эпителия и проходят через всю толщу слизистой оболочки, достигая подслизистого слоя. Со временем сальмонеллы достигают кишечных лимфоидных фолликулов и мезентериальных дренирующих лимфатических узлов. Будучи захваченными фагоцитами (нейтрофилами и макрофагами), сальмонеллы демонстрируют способность выживать и размножаться внутри этих клеток, находясь в особых вакуолях. В случае системной инфекции сальмонеллы выявляются в лимфоузлах, печени и селезенке.

Сальмонеллы используют несколько механизмов для проникновения внутрь клеток (pис. 3). Нейтрофилы и макрофаги обладают природной способностью захватывать микроорганизмы в специализированные вакуоли (фагосомы) и уничтожать интернализованные патогены - это один из механизмов врождённого иммунитета. В эпителии тонкого кишечника присутствуют специализированные эпителиоциты, которые также обладают выраженной способностью к фагоцитозу. Это M-клетки, которые располагаются над скоплениями лимфоидной ткани в слизистой (пейеровыми бляшками). В дистальных отделах тонкого кишечника примерно 10% эпителиоцитов являются M-клетками. Способность M-клеток фагоцитировать микроорганизмы позволила предположить, что при развитии инфекции этот тип клеток является одной из первых мишеней для вторжения сальмонелл. Сальмонеллы подвергаются фагоцитозу, однако способны подавлять механизмы внутриклеточного уничтожения, что позволяет этим бактериям выживать и размножаться внутри фагоцитов.

Интернализация сальмонелл происходит и в клетки, не обладающие естественной способностью к фагоцитозу, в том числе в каёмчатые энтероциты, которые образуют 90% поверхности эпителия тонкого кишечника. Этот механизм чрезвычайно эффективен, интернализация происходит через минуты после контакта сальмонелл с эпителиальными клетками. После адгезии сальмонеллы к плазматической мембране эукариотической клетки бактерия инъецирует в клетку набор белков, которые приводят к локальной модификации цитоскелета и образованию многочисленных выступов плазматической мембраны поблизости от места прикрепления бактерии. Выступы мембраны образуют складки (т.н. оборки, ruffles), в которых происходит аггрегация элементов цитоскелета. Складки мембраны окружают бактерию со всех сторон и в конце сливаются. В результате, бактериальная клетка оказывается внутри мембранного пузыря (макропиносомы) [28]. Данный механизм интернализации получил название индуцированной или T3SS1-зависимой инвазии, поскольку важнейшую роль в этом механизме играет бактериальная система секреции белков третьего типа (type 3 secretion system 1, T3SS1). Роль T3SS1 в инвазии заключается в том, что эта система позволяет бактерии инъецировать в эукариотическую клетку бактериальные белки SipA, SipC, SopB, SigD, SopD, SopE/SopE2 и SptP, ответственные за перестройку цитоскелета.

Кроме этого, для некоторых типов эукариотических клеток описана T3SS1-независимая инвазия, которая происходит при участии бактериальных адгезинов (фимбриальных или нефимбриальных) [29] (рис. 3).

После интернализации сальмонеллы выживают и размножаются во внутриклеточных мембранных компартментах, которые получили название вакуолей, содержащих сальмонеллы (salmonella-containing vacuoles, SCV). Способность формировать SCV и выживать в них рассматривается в качестве важнейшей цитологической характеристики патогенности, что в случае сальмонелл иллюстрируется работой систем секреции T3SS1 и T3SS2 (описаны ниже) [30]. Вакуоли SCV биохимически отличаются от нормальных фагосом; они, в частности, не сливаются с лизосомами. Данное обстоятельство может быть одной из причин, почему сальмонеллы избегают внутриклеточного уничтожения [31]. После своего образования на периферии клетки, SCV быстро мигрируют внутри клетки по направлению к аппарату Гольджи и располагаются в перинуклеарной зоне. В этот период бактерии внутри SCV размножаются. В ходе дальнейшего развития внутриклеточной инфекции в клетке хозяина формируется характерное патолого-цитологическое образование в виде сети мембранных трубочек, идущих от перинуклеарной области по направлению к периферии клетки, которые получили название филаментов, индуцированных сальмонеллами (salmonella-induced filaments, SIF) (рис. 3). SIF замыкаются внутри клетки (не открываются во внешнюю среду), полость SIF соединяется с полостью SCV [32].




Рис. 3. Сальмонеллы являются факультативными внутриклеточными паразитами и выживают внутри особых вакуолей (SCV). Сальмонеллы проникают в клетки разных типов посредством фагоцитоза, T3SS1-опосредованной инвазии и T3SS1-независимой инвазии. Факторы вирулентности, необходимые для инвазии, внутриклеточных выживания и репликации сальмонелл, перечислены на рисунке.


Система секреции T3SS1 участвует в инвазии и индуцирует диарею


Важнейшей для инвазии сальмонелл и биогенеза SCV, а также для запуска ряда механизмов, обеспечивающих внутриклеточное выживание сальмонелл, является бактериальная система секреции T3SS1. Система T3SS1 позволяет сальмонеллам транслоцировать белковые факторы вирулентности из бактериальной цитоплазмы в цитоплазму клетки хозяина. По меньшей мере пятнадцать разных эффекторных белков транслоцируются при участии T3SS1 [28]. Среди таких белков-эффекторов - SipA, SopB и SopE/SopE2, которые кооперативно взаимодействуют с актиновым цитоскелетом и вызывают его перестройки, необходимые для инвазии [33]. Тирозин фосфатаза SptP необходима для отключения механизма формирования складок на плазматической мембране после замыкания первичной макропиносомы.

Одним из наиболее частых симптомов сальмонеллеза является диарея. Сальмонеллы индуцируют у хозяина диарею при помощи набора токсичных белков, которые транслоцируются в энтероциты при помощи T3SS1 [16]. В частности, SopB приводит к неконтролируемому открыванию ионных каналов, через которые происходит потеря ионов хлора, что сопровождается усиленной секрецией воды из энтероцитов [34].

Другой эффектор T3SS1 - SipA требуется для позиционирования SCV в периядерной области; убиквитин-подобная ацетилтрансфераза/цистеиновая протеаза AvrA подавляет воспалительную реакцию и предотвращает апоптоз энтероцитов [35].

Система T3SS1 представляет собой многокомпонентную структуру, включающую т.н. внутреннее кольцо, закреплённое в липидной мембране бактериальной клетки (с цитоплазматической стороны к внутреннему кольцу примыкает АТФ-зависимый экспортный комплекс); внешнее кольцо, закреплённое в клеточной стенке бактерии; и иглоподобную структуру, которая выступает над поверхностью бактерии (рис. 4). Через все структуры проходит полая белковая трубка, т.н. внутренний стержень, который непосредственно взаимодействует с другой структурой, внедряемой бактерией в плазматическую мембрану клетки хозяина (транслоказой) [36]. В сборке T3SS принимают участие не менее 20 структурных и регуляторных белков [36]. Внутреннее кольцо образовано белками PrgH и PrgK. Экспортный аппарат, обращённый в цитоплазму бактериальной клетки, состоит из InvA, InvC, SpaP, SpaQ, SpaR и SpaS. В образовании внешнего кольца принимают участие белки InvG и InvH; внешнее кольцо соединяется с внутренним при помощи InvJ. Иглоподобная структура и внутренний стержень собираются из PrgJ и PrgI, соответственно [36]. Иглоподобная структура и внутренний стержень не пронизывают плазматическую мембрану клетки хозяина и не могут непосредственно вводить эффекторы в цитозоль эукариотической клетки. Для этой цели внутренний стержень взаимодействует с транслоказой, встроенной в мембрану клетки-хозяина. Транслоказа собирается из бактериальных белков, которые составляют группу первых эффекторов, выделяемых через T3SS [36].




Рис. 4. Система секреции типа 3 (T3SS) обеспечивает транспорт эффекторных белков из бактериальной клетки в цитоплазму клетки хозяина. Система T3SS включает в себя базальную структуру и иглоподобную структуру, внутри которых проходит полый внутренний стержень. Открытый конец внутреннего стержня взаимодействует с транслоконом - порой в плазматической мембране клетки хозяина, образованной встроенными в неё бактериальными белками.


Система секреции T3SS2 обеспечивает внутриклеточное выживание и системную инфекцию

Система секреции T3SS2 устроена подобно вышеописанной системе T3SS1, однако гены структурных белков T3SS2 экспрессируются только в период внутриклеточного существования бактерии. В числе факторов, индуцирующих сборку системы T3SS2, описаны условия, соответствующие внутренней среде SCV: низкая осмолярность, низкие концентрации питательных веществ и кислая среда. Система T3SS2 служит для транслокации соответствующих эффекторных белков в цитоплазму клетки-хозяина через мембрану SCV. Активность системы T3SS2 требуется для выживания сальмонелл внутри инфицированных клеток и для способности бактерии вызывать системную инфекцию. Хотя роли отдельных белков-эффекторов T3SS2 ещё недостаточно описаны, известно, что ряд из них (SseF и SseG) участвуют во внутриклеточном позиционировании SCV [37]. Белок SifA требуется для поддержания целостности мембраны SCV; у мутантов сальмонелл с выключенным геном sifA бактериальные тела оказываются в цитозоле [38]. Белки PipB2 и SseJ нужны для формирования Sif, в частности, PipB2 взаимодействует с моторным комплеком кинезина-1, который обеспечивает транспорт вдоль микротрубочек. PipB2 закрепляет моторный комплекс на поверхности SCV, что приводит к удлинению мембранных каналов Sif в сторону от SCV, по направлению к периферии клетки-хозяина [39]. Белок SpiC в цитоплазме инфицированных макрофагов обнаруживается в форме, связанной с внутриклеточными мембранами, и препятствует внутриклеточному везикулярному транспорту. Эта функция, вероятно, препятствует слиянию SCV с лизосомами.

Системная инфекция является тяжелой формой сальмонеллеза и происходит в результате диссеминации сальмонелл по организму хозяина внутри инфицированных мигрирующих макрофагов и нейтрофилов (т.н. трансмиграция) [40]. Эффекторы T3SS2 подавляют презентацию антигенов сальмонелл инфицированными макрофагами [41]. В органах и тканях за пределами кишечного эпителия сальмонеллы могут распространяться из инфицированных фагоцитов в разные типы клеток, у которых индуцируют апоптоз [30].


Островки патогенности


Гены белков системы T3SS1 кластеризуются в области хромосомной ДНК, называемой островком патогенности 1 (SPI-1, от «salmonella pathogenicity island 1»). Островки патогенности – это геномные локусы, которые содержат гены факторов вирулентности и контролируют такие жизненно-важные для бактерии характеристики, как способность к адгезии, инвазии, подавлению защитных механизмов и синтезу токсинов. Островки патогенности могут быть расположены на хромосоме или на плазмидах и часто ассоциированы с транспозонами. Из числа белок-кодирующих последовательностей, имеющих отношение к T3SS1, локус SPI-1 содержит гены структурных белков prgHIJK, spaMNOPQRS, и invABCEFGH, а также гены белков-индукторов экспрессии T3SS1 (HilA) и белков-эффекторов [33].

Гены системы T3SS2 расположены в островке патогенности 2 (SPI-2). Это гены структурных белков (ssaGHIJKLMNOPQRSTU), эффекторов (sseABCDEF), шаперонов (sscAB) и регуляторов (ssrAB). Экспрессия генов локуса SPI-2 управляется двумя белками (SsrA и SsrB), а система SsrA/SsrB, в свою очередь, регулируется бактериальными стрессовыми сенсорами OmpR-EnvZ [42].


Плазмидные факторы вирулентности


Некоторые плазмиды сальмонелл несут кластеры генов вирулентности и поэтому называются плазмидами вирулентности. У большинства сероваров сальмонелл плазмиды вирулентности не обнаружены, однако у наиболее важных сероваров с точки зрения здравоохранения (в том числе у Typhimurium, Enteritidis и Choleraesuis) плазмиды вирулентности имеются [43]. Плазмиды вирулентности сальмонелл гетерогенны по размерам (50–90 kb), однако все они имеют особую область протяжённостью 7.8 kb, которая называется локусом SPV (salmonella plasmid virulence). Показано, что именно наличие локуса SPV придаёт плазмидосодержащим штаммам высоковирулентный фенотип, в частности, способность к размножению внутри клеток ретикулоэндотелиальной системы. Плазмиды вирулентности существенно увеличивают способность содержащего их штамма вызывать системную инфекцию. В экспериментах на животных моделях влияние присутствия плазмиды вирулентности на свойства штамма существенно: 50%-ная летальная доза (LD50) при наличии плазмиды в 10-10^6 раз ниже, чем у тех же штаммов, искусственно избавленных от плазмиды вирулентности.

Локус SPV содержит пять генов (spvRABCD). Наилучшим образом изучены функции белка SpvB (66 kDa), про который известно, что он абсолютно необходим для плазмид-ассоциированной вирулентности и транслоцируются через систему T3SS2 [44]. SpvB является АДФ-рибозилтрансферазой, которая АДФ-рибозилирует актин и дестабилизирует цитоскелет [45].

Кроме SPV, в плазмидах вирулентности закодированы т.н. дополнительные факторы вирулентности – гены фимбрий (оперон pefBACDI) и гены резистентности к комплементу (rck и rsk). Большинство плазмид вирулентности сальмонелл не являются конъюгативными, но некоторые несут полный набор генов трансмиссивности (tra). Отмечено, что плазмиды вирулентности наиболее часто встречаются у сероваров, адаптированных к хозяину (host-adaptated); вероятно, наличие плазмиды резистентности позволяет сальмонеллам таких сероваров колонизировать более широкий спектр хозяев.


Кворум-чувствительность сальмонелл


Бактерии обмениваются химическими сигналами и проявляют способность к скоординированной реакции на изменения условий среды, что получило название кворум-чувствительности. Механизм кворум-чувствительности включает, во-первых, синтез и секрецию бактериями гормоноподобных сигнальных молекул и, во-вторых, детекцию химических сигналов этими же (секретирующими) и другими бактериями. Соответствующие сигнальные молекулы получили название аутоиндукторов [46]. Аутоиндукторами, как правило, являются низкомолекулярные вещества (лактоны, фураноны, небольшие пептиды и пр.), которые могут свободно диффундировать через мембрану и клеточную стенку бактерии. При малом количестве бактерий в среде аутоиндуктор быстро выходит из бактериальных клеток посредством пассивной диффузии и теряется. При высоких плотностях бактериальной популяции аутоиндуктор накапливается внутри бактериальной клетки до концентрации, равной его концентрации в среде [47]. Как только концентрация аутоиндуктора достигает критической пороговой концентрации, в клетке бактерии изменяется характер экспрессии ряда генов, что сопровождается фенотипическими эффектами [47]. В частности, такое изменение приводит к усилению биосинтеза того же аутоиндуктора, что создаёт в системе положительную обратную связь. В результате, в большом объёме культуры происходит скоординированное (почти одновременное) переключению фаз жизненного цикла у бактерий, чувствительных к данному аутоиндуктору. Таким образом, кворум-чувствительность проявляется в способности бактерий определять плотность бактериальной популяции и, в зависимости от плотности, экспрессировать разные фенотипы. Полная система кворум-чувствительности у бактерий включает два компонента: синтетазу аутоиндуктора и сенсор (белок-рецептор, свойства которого изменяются при связывании аутоиндуктора). Роль сенсора обычно заключается в активации транскрипции определённых генов.

К настоящему времени у сальмонелл описана чувствительность к двум аутоиндукторам разной химической структуры (рис. 5). У сальмонелл имеется система кворум-чувствительности SdiA/AHL, компоненты которой подобны эффекторам системы LuxR/LuxS/AHL, широко распространённой среди грамотрицательных микроорганизмов. Аутоиндукторами в системах кворум-чувствительности, зависящих от AHL, являются N-ацилгомосерин лактоны (AHL), а именно: у сальмонелл это oxoC8 и oxoC6 (pис. 5). Сенсорный белок сальмонелл SdiA (аналог рецептора LuxR) демонстрирует высокую аффинность к oxoC8 (константа диссоциации, Kd=1 nM) и к oxoC6 (Kd=5 nM). Связывание SdiA с аутоиндуктором приводит к активации гена srgE (предсказано, что белок SrgE - один из эффекторов, транслоцируемых через T3SS1) и оперона rck (содержит гены устойчивости к комплементу), а также к запуску регуляторного каскада sirA-hilA/hilC; конечным итогом является активация генов островка патогенности 1 (SPI-1) [48]. Сальмонеллы производят сенсорный белок SdiA, но не продуцируют собственную синтетазу AHL (LuxS). При этом сальмонеллы высокочувствительны к присутствию в среде их обитания ряда кишечных патогенов (например, таких как Aeromonas hydrophila, Hafnia alvei и Yersinia enterocolitica), и показано, что сальмонеллы эффективно детектируют присутствие химических вариантов AHL, продуцируемых другими энтеропатогенными микроорганизмами. Высказано предположение, что сальмонеллы используют свою систему SdiA/AHL для усиления собственной вирулентности в ситуации конкуренции со стороны других патогенных видов бактерий [49].

Другая система кворум-чувствительности у сальмонелл - это LuxPQ/LuxS/AI-2. Интересен боросодержащий аутоиндуктор этой системы AI-2, представляющий собой циклический диэфир фуранозильного производного и борной кислоты (рис. 5). Роль AI-2-зависимой кворум-чувствительности в адаптации сальмонелл и соответствующие регуляторные каскады пока недостаточно изучены.




Рис. 5. (A) Химические структуры сигнальных молекул (аутоиндукторов) сальмонелл. (B) Присутствующий во внешней среде ацилгомосерин лактон (AHL), продуцируемый конкурирующими видами энтеробактерий, связывается с сенсорным белком SdiA сальмонелл, что активирует регулоны rck, srgE и гены системы T3SS1 (усиление инвазии). (C) Результаты эксперимента, подтверждающего способность сальмонелл детектировать AHL, продуцируемый другими видами энтеробактерий (Hafnia alvei и Yersinia enterocolitica). Штаммы сальмонелл BA1101 sdiA+ (продуцирующий sdiA) и BA1301 sdiA- (не продуцирующий sdiA) были высеяны на чашки, содержащие по одной большой колонии H. alvei или Y. enterocolitica. Оба штамма сальмонелл несут встроенный в геном дополнительный ген бета-галактозидазы под контролем промотора гена srgE. Продукция бета-галактозидазы приводит к окрашиванию агара на чашке в сине-зелёный цвет. В данном эксперименте интенсивность окрашивания зависит от концентрации AHL и максимальна вблизи колонии другого вида энтеробактерий. Фотография из работы [50].


Выводы


В последние 20 лет был достигнут значительный прогресс в нашем понимании того, как сальмонеллы взаимодействует с клетками хозяина. Тем не менее, сохраняется необходимость в совершенствовании экспериментальных систем, таких как ко-культивирование или 3D-культуры, которые лучшим образом воспроизводят условия взаимодействия сальмонелл с организмом хозяина in vivo.


Литература


1. Battistuzzi F.U., Feijao A. & Hedges S.B. (2004). A genomic timescale of prokaryote evolution: insights into the origin of methanogenesis, phototrophy, and the colonization of land. BMC Evol Biol 4: 44.

2. Bleasdale B., Lott P.J., Jagannathan A., Stevens M.P., Birtles R.J. & Wigley P. (2009). The Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system is essential for the survival of Salmonella enterica serovar Typhimurium in free-living amoebae. Appl Environ Microbiol 75: 1793-1795.

3. Jablasone J., Warriner K. & Griffiths M. (2005). Interactions of Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes plants cultivated in a gnotobiotic system. Int J Food Microbiol 99: 7-18.

4. Schikora A., Virlogeux-Payant I., Bueso E., Garcia A.V., Nilau T., Charrier A., Pelletier S., Menanteau P., Baccarini M., Velge P. & Hirt H. (2011). Conservation of Salmonella infection mechanisms in plants and animals. PLoS One 2011 6(9).

5. Popoff M.Y., Bockemuhl J., Brenner F.W. & Gheesling L.L. (2001). Supplement 2000 (no. 44) to the Kauffmann-White scheme. Res Microbiol 152: 907-909.

6. Andrews H. L. & Baumler A. J. (2005). Salmonella species. In: Fratamico, P. M., Bhunia, A. K. & Smith, J. L. (Eds.). Foodborne pathogens: Microbiology and molecular biology, p. 327-339. United Kingdom: Horizon Scientific Press Ltd.

7. Steinbach G., Lauterbach L. & Methner U. (2000). Studies of the phenomenon of host adaptation in Salmonella. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 47: 707-719.

8. Boyen F., Haesebrouck F., Maes D., Van Immerseel F., Ducatelle R. & Pasmans F. (2008). Non-typhoidal Salmonella infections in pigs: A closer look at epidemiology, pathogenesis and control. Veterinary Microbiology 130(1-2): 1-19.

9. Fierer J. & Guiney D.G. (2001). Diverse virulence traits underlying different clinical outcomes of Salmonella infection. J Clin Invest 107: 775-780.

10. Yousef A.E. & Carlstrom C. (2003). Salmonella. In: Yousef A.E. & Carstrom C. (Eds.). Food microbiology: A laboratory manual, p. 167-205. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey. USA.

11. Crump J.A., Luby S.P. & Mintz E.D. (2004). The global burden of typhoid fever. Bull World Health Organ 82: 346-353.

12. CDC. No authors listed (2005). Salmonella surveillance: Annual summary, 2004. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA.

13. de Jong H. & Ekdahl M.O. (2006). The comparative burden of salmonellosis in the Europian Union member states, associated and candidate countries. BMC Public Health 6: 4-12.

14. Cox J.M. & Pavic A. (2010). Advances in enteropathogen control in poultry production. J App Microbiol 108: 745-755.

15. Oliveira M., Wijnands L., Abadias M., Aarts H. & Franz E. (2011). Pathogenic potential of Salmonella Typhimurium DT104 following sequential passage through soil, packaged fresh-cut lettuce and a model gastrointestinal tract. Int J Food Microbiol 148, 149-155.

16. Voetsch A.C., Van Gilder T.J., Angulo F.J., Farley M.M., Shallow S., Marcus R., Cieslak P.R., Wallis T.S. & Galyov E.E. (2000). Molecular basis of Salmonella-induced enteritis. Mol Microbiol 36: 997-1005.

17. Threlfall E.J., Hampton M.D., Schofield S.L., Ward L.R., Frost J.A. & Rowe B. (1996). Epidemiological application of differentiating multiresistant Salmonella typhimurium DT104 by plasmid profile. Commun Dis Rep CDR Rev 6: R155-9.

18. Sefton A.M. (2002). Mechanisms of antimicrobial resistance: Their clinical relevance in the new millennium. Drugs 62: 557-566.

19. Bush K. (2003). Beta-lactam antibiotics: Penicillins. In: Finch R.G., Greenwood D., Norrby S.R. & Whitley R.J. (Eds.). Antibiotic and Chemotherapy: Anti-infective agents and their use in therapy, p. 224–258. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK.

20. Mulvey M., Soule G. & Boyd D. (2003). Characterization of the first extended-spectrum b-lactamase-producing Salmonella isolate identified in Canada. J Clin Microbiol 41: 460-462.

21. Fricke W.F., Welch T.J., McDermott P.F., Mammel M.K., LeClerc J.E., White D.G., Cebula T.A. & Ravel J. (2009). Comparative genomics of the IncA/C multidrug resistance plasmid family. J Bacteriol 191: 4750-4757.

22. Poole K. (2005). Aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 49: 479–487.

23. Butaye P., Cloeckaert A. & Schwarz S. (2003). Mobile genes coding for efflux-mediated antimicrobial resistance in gram-positive and gram-negative bacteria. Int J Antimicrob Agents 22: 205–210.

24. Hunter P.R., Wilkinson D.C., Catling L.A. & Barker G.C. (2008). Meta-analysis of experimental data concerning antimicrobial resistance gene transfer rates during conjugation. Appl Environ Microbiol 74: 6085-6090.

25. Trun N.J. (2004). Fundamental bacterial genetics. Blackwell Publishers. USA.

26. Bearson S.M., Bearson B.L. & Rasmussen M.A. (2006). Identification of Salmonella enteric serovar Typhimurium genes important for survival in the swine gastric environment. Appl Environ Microbiol 72: 2829–2836.

27. Althouse C., Patterson S., Fedorka-Cray P. & Isaacson R.E. (2003). Type 1 fimbriae of Salmonella enterica serovar Typhimurium bind to enterocytes and contribute to colonization of swine in vivo. Infect Immun 71: 6446–6452.

28. McGhie E.J., Brawn L.C., Hume P.J., Humphreys D. & Koronakis V. (2009). Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr Opin Microbiol 12: 117-124.

29. Guo A., Lasaro M.A., Sirard J.C., Kraehenbuhl J.P. & Schifferli D.M. (2007). Adhesin-dependent binding and uptake of Salmonella enterica serovar Typhimurium by dendritic cells. Microbiology 153: 1059–1069.

30. Tierrez A., & Garcia-del Portillo F. (2005). New concepts in Salmonella virulence: The importance of reducing the intracellular growth rate in the host. Cell Microbiol 7: 901-909.

31. Holden D.W. (2002). Trafficking of the Salmonella vacuole in macrophages. Traffic 3: 161-169.

32. Drecktrah D., Levine-Wilkinson S., Dam T., Winfree S., Knodler L.A., Schroer T.A. & Steele-Mortimer O. (2008). Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic 9: 2117-2129.

33. Lostroh C.P. & Lee C.A. (2001). The Salmonella pathogenicity island-1 type III secretion system. Microbes Infect 3: 1281–1291.

34. Bertelsen L.S., Paesold G., Marcus S.L., Finlay B.B., Eckmann L. & Barrett K.E. (2004). Modulation of chloride secretory responses and barrier function of intestinal epithelial cells by the Salmonella effector protein SigD. Am J Physiol Cell Physiol 287: 939-948.

35. Jones R.M., Wu H., Wentworth C., Luo L., Collier-Hyams L. & Neish A.S. (2008). Salmonella AvrA Coordinates Suppression of Host Immune and Apoptotic Defenses via JNK Pathway Blockade. Cell Host Microbe 3: 233-244.

36. Galan J.E. & Wolf-Watz H. (2006). Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature 444: 567-573.

37. Kuhle V. & Hensel M. (2002). SseF and SseG are translocated effectors of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 that modulate aggregation of endosomal compartments. Cell Microbiol 4: 813-824.

38. Beuzon C.R., Salcedo S.P. & Holden D.W. (2002). Growth and killing of a Salmonella enterica serovar Typhimurium sifA mutant strain in the cytosol of different host cell lines. Microbiology 148: 2705-2715.

39. Henry T., Couillault C., Rockenfeller P., Boucrot E., Dumont A. & Schroeder N. (2006). The Salmonella effector protein PipB2 is a linker for kinesin-1. Proc Natl Acad Sci USA 103: 13497-13502.

40. Sundquist M., Rydstrom A. & Wick M.J. (2004). Immunity to Salmonella from a dendritic point of view. Cell Microbiol 6: 1–11.

41. Waterman S.R., & Holden D.W. (2003). Functions and effectors of the Salmonella pathogenicity island 2 type III secretion system. Cell Microbiol 5: 501-511.

42. Garmendia J., Beuzon C.R., Ruiz-Albert J. & Holden D.W. (2003). The roles of SsrA-SsrB and Ompr-Envz in the regulation of genes encoding the Salmonella typhimurium SPI-2 type III secretion system. Microbiology 149: 2385-2396.

43. Villa L. & Carattoli A. (2005). Integrons and transposons on the Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence plasmid. Antimicrob Agents Chemother 49: 1194-1197.

44. Browne S.H., Hasegawa P., Okamoto S., Fierer J. & Guiney D.G. (2008). Identification of Salmonella SPI-2 secretion system components required for SpvB-mediated cytotoxicity in macrophages and virulence in mice. FEMS Immunol Med Microbiol 52: 194-201.

45. Kurita A., Gotoh H., Eguchi M., Okada N., Matsuura S., Matsui H., Danbara H. & Kikuchi Y. (2003). Intracellular expression of the Salmonella plasmid virulence protein, SpvB, causes apoptotic cell death in eukaryotic cells. Microb Pathog 35: 43-48.

46. Reading N.C. & Sperandio V. (2006). Quorum sensing: The many languages of bacteria. FEMS Microb Lett 254: 1-11.

47. Gobbetti M., De Angelis M., Di Cagno R., Minervini F. & Limitone A. (2007). Cell-cell communication in food related bacteria. Int J Food Microbiol 120(1-2): 34-45.

48. Dyszel J.L., Smith J.N., Lucas D.E., Soares J.A., Swearingen M.C., Vross M.A., Young G.M. & Ahmer B.M. (2010). Salmonella enterica serovar Typhimurium can detect acyl homoserine lactone production by Yersinia enterocolitica in mice. J Bacteriol 192: 29-37.

49. Michael B., Smith J.N., Swift S., Heffron F. & Ahmer B.M. (2001). SdiA of Salmonella enterica is a LuxR homolog that detects mixed microbial communities. J Bacteriol 183: 5733-5742.

50. Smith J.N. & Ahmer B.M. (2003). Detection of other microbial species by Salmonella: expression of the SdiA regulon. J Bacteriol 185(4): 1357-1366.


Түйін


Сальмонеллалар адамдар мен жануарларда жиі кездесетін ауруларға әкеліп соқтыра отырып, үлкен моральдық және экономикалық шығынның себепшісі болып келеді. Сальмонеллалардың антибиотикке тұрақты штамдарының көптеп кездесуі денсаулық сақтау мен ветеринарияның маңызды проблемасы болып келе жатыр. Әртүрлі штамдардың патогенетикалық және микроэкологиялық ерекшеліктерімен қоса келе Salmonella туысының көптеген түрлері (2500-ден аса сероварлар) бактериялар молекулалық генетикасы мамандарының назарын аударды.

Бұл шолуда сальмонеллалардың классификациясы, номенклатурасы, клиникалық ерекшеліктері, эпидемиологиясы және энтеробактериялардың бұл туысының вируленттілігінің молекулалық детерминанты мен антибиотик тұрақтылығының проблемалары бар.


Summary


Infection with salmonella is a common cause of illness in humans and animals and accounts for huge moral and economic losses. The ubiquity of antibiotic-resistant strains of salmonella has become an important problem of public health and veterinary medicine. Remarkable diversity of the genus Salmonella (over 2,500 serovars), in conjunction with the pathogenetic and microecological variations in different serovars attracts growing attention from molecular genetics.

This review is to discuss a classification and nomenclature of Salmonella, clinical features, epidemiology and problems of antibiotic resistance and molecular determinants of virulence in this genus of enterobacteria.


Добавить документ в свой блог или на сайт
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconРекомендации удк 619: 616. 9-085: 579. 852. 13Н эффективность препаратов при некробактериозе животных // Молочное и мясное скотоводство. 2006. №4. С. 39-41

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУдк 619: 616. 981. 55: 636. 2

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУчебное пособие Москва 2012 удк 619: 579(07) Грязнева Т. Н., Родионова В. Б., Муравьева В. Б., Бурла-кова Г. И., Шайкова Н. В

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУчебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев, А. А. Щербаков, Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин удк 619: 616

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУчебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев А. А. Щербаков Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин > И. Г. Швиденко удк 619: 616

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУдк 619: 616. 9(06) 619: 578. 824. 11 Разработка и оптимизация условий постановки тест-системы для диагностики бешенства сэндвич методом твердофазного иммуноферментного анализа
Ргп «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» кн мон рк, пгт. Гвардейский, Кордайский район, Жамбылская...

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУдк 619: 616. 98. 578. 828. 11Л современные аспекты серологической диагностики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУдк 619: 616-07 Метод выделения ДНК и тест-система пцр в реальном времени для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУдк: 616-017. 1: 616. 33/34-085

Удк 619: 616. 98: 579. 842. 14 Сальмонеллы: молекулярные механизмы приспособленности и факторы вирулентности iconУдк 619: 616. 98: 578. 824. 11: 57. 083. 223 Идентификация и выделение уличных изолятов вируса бешенства
Выделение вируса бешенства из патологических материалов проводили путем изоляции на кроликах. В ходе исследований были изучены патогенные...

Поместите кнопку у себя на сайте:
Образование


База данных защищена авторским правом ©cow-leech 2000-2013
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
COW-LEECH.RU